뮤신 평가를 위한 특수 염색 기법

뮤신(Mucins)은 고분자량의 당단백질로 소화기관, 호흡기관 및 생식기관의 상피조직에 두루 분포해 있습니다. 뮤신은 단백질 중심부에 여러 탄수화물 사슬(다당류)이 연결되어 있는 구조입니다. 뮤신의 탄수화물 성분은 분자량의 약 60~80%를 차지합니다. 단백질 중심부에서는 아미노산인 세린과 트레오닌 함량이 높습니다. 뮤신의 구조적 특징은 단백질 중심부 내 특정 아미노산 서열이 반복적으로 나타난다는 점입니다. 분자 관점에서 뮤신은 반복되는 서열과 크기의 차이에 따라 특정군(Muc 1, Muc 2, Muc 3 등)으로 분류됩니다.

다른 당단백질 분자 중 상당수가 뮤신과 유사한 구조적 특징을 가지고 있으므로 뮤신과 혼동되는 경우가 많습니다. 프로테오글리칸(proteoglycan)은 고분자량 당포합체 화합물로, 세포 외 기질 뿐만 아니라 결합 조직 내에서 고농도로 발견됩니다. 이전 문헌에서는 프로테오글리칸을 결합 조직 뮤신이라고 했습니다. 그러나 구조(특히 프로테오글리칸의 단백질 중심부)는 뮤신의 구조와 확연히 다릅니다.

뮤신의 단백질 중심부는 특수 염색법에 사용되는 염료와 뮤신의 조직화학적 반응에 거의 기여하지 않습니다. 실제로 조직화학적 반응은 뮤신 탄수화물 구성에 크게 영향을 받습니다. "탄수화물"이라는 용어는 백여 년 전 일반 분자식 C_n(H20)_n에서 다양한 분자군을 설명하기 위해 사용되기 시작했습니다. 실제로 "탄수화물"은 기술적으로 탄소 분자와 물 분자(수화물)가 1:1 비율로 결합한 구조를 가리키기도 합니다. 포도당 분자(그림 1)는 기본 탄수화물 단당류 구조를 보여줍니다. 이와 유사한 단당류로는 만노스와 갈락토스가 있습니다. 이러한 분자는 전하를 띠지 않으므로 정상 조건에서 이온화 되지 않습니다. 반면 다른 단당류에는 이온화가 가능하여 분자 전체에 음전하를 띠게 하는 카르복실(COOH)군 및 술폰산(SO₃H)군과 같은 산성군도 있습니다. 시알산으로 널리 알려진 카르복실화 단당류 N-아세틸뉴라민산은 (그림 2)와 같습니다. 이러한 유형으로 조직화학 염색과의 잠재적 반응을 어느 정도 예측할 수 있습니다.

조직화학 관점에서 뮤신은 뮤신의 탄수화물 성분의 화학적 특성과 구조에 따라 크게 두 가지 범주 중 하나에 속합니다. 전하를 띠는 ""산성"" 뮤신에는 카르복실산(COO^-)군 또는 술폰산염(SO₃)군이 함유된 탄수화물이 포함됩니다. 이 두 군 모두 생리학적 pH에서 이온화되어 뮤신 분자 전체에서 음전하가 생성됩니다. 중성 뮤신의 탄수화물 사슬에는 산성군이 부족해 순전하를 전달하지 않습니다. 중성 뮤신은 주로 위 표면 상피조직, 십이지장의 브루너샘 및 전립선 상피조직에서 발견됩니다. 산성 뮤신은 소화기관과 호흡기 전체에 걸쳐 광범위하게 분포되어 있습니다.

일반적인 뮤신 특수 염색에는 특정 pH의 용액에서 양전하를 띠는 양이온 염료 분자가 함유되어 있습니다. 이는 뮤시카민(mucicarmine), 알시안 블루(alcian blue)뿐만 아니라 아주르 A(azure A) 또는 톨루이딘 블루(toluidine blue)와 같은 이전 이염색법의 염료에서도 마찬가지입니다. 양이온 염료 분자는 정전기력을 통해 뮤신 분자의 음이온성 카르복실화 또는 황산화 다당류 사슬과 결합합니다.

뮤시카민은 뮤신을 검출하는 데 사용되는 염색법에서 가장 오래된 염색법 중 하나입니다. 예전만큼 널리 사용되고 있지 않지만 여전히 뮤시카민은 산성 뮤신 검사, 특히 소화기관 검사에 유용한 염색법입니다. 또한 이 염색법은 크립토코커스 네오프로만스(Cryptococcus neoformans) 균의 캡슐을 염색하는 데에도 유용합니다.

뮤시카민 염색에서 발견되는 활성 염료 분자는 양이온 알루미늄 이온과 카르민산 사이에서 형성된 킬레이트 복합체입니다. 카르민산은 연지벌레(Coccus cacti) 암컷을 말린 몸체에서 추출한 천연 염료 분자입니다. 알루미늄 양이온이 대형 카르민 복합체 전체에 양전하를 띠게 합니다. 이 복합체가 어떻게 뮤신을 선택적으로 염색하는지 정확한 기전은 아직 밝혀지지 않았지만 산성 뮤신 음이온군의 정전기적 끌어당김이 원인이라는 연구 결과도 있습니다. 중성 뮤신이 풍부한 조직 부위는 거의 또는 전혀 염색되지 않지만 일반적으로 산성 뮤신이 함유된 소화기관 부위는 뮤시카민으로 강하게 염색되므로 이 이론을 뒷받침합니다.

알시안 블루는 대형 평면 프탈로시아닌 분자이며 중앙에는 구리 원자가 있습니다. 또한 이 분자에는 양전하를 띠는 기본 이소티오우로늄(isothiouronium)군 4개가 있습니다. 이러한 군에 의해 양전하가 전달되어 알시안 블루 염료 분자가 뮤신 분자의 음이온 부위와 결합됩니다. 뮤시카민과 마찬가지로 알시안 블루는 중성 뮤신을 염색하지 않습니다.

알시안 블루 용액의 pH를 조절하면 조직 표본 내 산성 뮤신을 하위 단위로 분류할 수 있습니다. 카르복실화 및 황산화 여부에 관계없이 모든 산성 뮤신은 pH 2.5에서 이온화되어 음이온군(COO, SO₃)을 생성합니다. 따라서 표준 알시안 블루 pH 2.5는 모든 산성 뮤신을 염색합니다(그림 3). 반면 카르복실화 탄수화물이 주로 함유된 뮤신은 알시안 블루 pH 2.5에서 강하게 염색되지만 pH 1.0에서는 염색되지 않습니다. 낮은 pH에서는 카르복실군이 이온화되지 않으므로 뮤신은 중성을 띠게 됩니다. 산성도가 높은 술폰산군은 pH 1에서도 이온화될 수 있으므로 이 pH에서도 염색됩니다.

콜로이드 철 염색법은 양전하를 띠는 철 이온(철 양이온)이 산성 뮤신의 음전하 카르복실과 황산화군 종말을 끌어당기는 특성을 기반으로 합니다. 페로시안화칼륨(potassium ferrocyanide)으로 처리하면 파란색의 페로사이안화철(ferric ferrocyanide) 또는 감청색 침전물을 형성되므로 이를 통해 결합된 철 이온이 검출되거나 시각화됩니다. 콜로이드 철 염색법은 산성 뮤신을 검출하는 방법 중 감도가 가장 높지만 알시안 블루와 같은 다른 염색법만큼 자주 사용되지 않습니다. 하지만 알시안 블루와 마찬가지로 콜로이드 철 염색법을 PAS(Periodic Acid–Schiff) 염색법과 함께 사용할 수 있습니다

PAS 염색법은 활용도가 가장 높고 당단백질, 탄수화물 및 뮤신 검출에 널리 사용되는 염색법입니다. 앞서 설명한 염색법들과 달리 PAS 염색법은 중성 뮤신을 염색할 수 있습니다. PAS 염색법의 반응성은 다당류 중 산성군의 존재 유무보다 단당류 단위의 구조를 기반으로 합니다.

PAS 염색법은 단당류 단위 내 자유 알데하이드군과 Schiff 시약의 반응으로 밝은 자홍색의 최종 결과물을 생성합니다. PAS 염색법의 초기 반응은 인접한 탄소 원자에 부착된 히드록실(OH)군의 산화입니다. 이러한 군을 1, 2 글리콜(glycol)이라고 합니다. 이러한 글리콜이 산화하면 Schiff에 반응하는 알데하이드군이 형성됩니다. 대부분 프로토콜에서 과요오드산(periodic avid) 0.5~1.0% 용액을 산화제로 사용합니다. Schiff 시약 처리 후 발현되는 염색의 강도는 조직 내 반응성 1, 2 글리콜군의 농도에 비례합니다. PAS 염색법에서는 중성 뮤신 검출뿐만 아니라 상당량의 시알산이 함유된 산성 뮤신의 검출에 대한 감도가 매우 높습니다. PAS 염색법은 뮤신 이외에도 글리코겐과 다양한 당단백질 검출에 사용됩니다. PAS 염색법은 기저막 시각화에도 매우 유용합니다. 기저막 구조에 Schiff 시약에 반응하는 당단백질이 있기 때문입니다.

알시안 블루와 PAS 염색법을 함께 사용하면 중성 뮤신에서 산성 뮤신을 구분할 수 있습니다. 대부분 프로토콜에서는 절편을 표준 알시안 블루(pH 2.5) 염색법으로 염색한 후 PAS 염색법으로 염색합니다. 알시안 블루는 pH 2.5에서 모든 산성 뮤신을 진한 파란색으로 염색하지만 중성 뮤신을 염색하지 않습니다. PAS 염색법을 추가로 사용하면 중성 뮤신이 밝은 자홍색으로 염색됩니다. 중성 및 산성 뮤신이 모두 함유된 조직이나 세포는 진한 파란색이나 자주색으로 나타날 수 있습니다(그림 4). 알시안 블루와 PAS 염색법을 같이 사용하면 여러 가지 면에서 유용합니다. 중성 뮤신과 산성 뮤신의 분포나 발현 패턴의 변화는 특정 병리학적 상태를 나타낼 수 있습니다. 또한 알시안 블루/PAS 이중염색에서는 모든 뮤신이 뮤신의 전하 특성에 관계없이 반응하므로 감도가 가장 높으면서도 포괄적인 염색법이라 할 수 있습니다.

그림