고정 및 고정액(5) – 품질, 열 효과, 마이크로파를 최적화하기 위한 실용적 절차

단순하고 상식적인 원칙을 따름으로써 고품질의 일관된 고정 결과를 달성할 수 있습니다. 다음은 바람직한 고정을 위한 3가지 필수 사항과 이를 달성하기 위해 따라야 할 20가지 규칙입니다.

필수 사항 1: 신선 조직

1. 가능한 빨리 고정합니다.
   세포에 혈액 공급이 중단되는 즉시 변성이 시작됨을 명심합니다.
2. 즉시 고정할 수 없다면, 냉장 보관하고 냉동하지 마십시오.
   느린 조직 동결은 얼음 결정 형성으로 인해 상당한 손상을 가져옵니다.
3. 신선 조직은 전염성이 있을 수 있습니다.
   신선 또는 불완전하게 고정한 조직은 여러분과 실험실의 다른 직원들에게 잠재적으로 전염성이 있는 것으로 간주하십시오.
4. 표본이 건조되지 않게 하십시오.
   표본 표면 건조는 영구적인 손상을 초래할 것이며, 병리학적 변화를 가릴 수 있습니다. 작은 내시경 표본은 특히 이러한 손상에 취약합니다.
5. 조직을 비틀지 마십시오.
   신선한 조직을 거칠게 다루지 마십시오. 비틀기 또는 기타 물리적 손상은 영구적인 형태 변화를 초래하여 해석을 어렵게 만들 수 있습니다.
6. 빠짐 없이 정확하게 라벨을 표시합니다.
   이는 진단 및 연구 과정에 절대적으로 필요합니다.

필수 사항 2: 고정액의 적절한 침투

7. 고정액은 모든 측면에서 침투해야 합니다.
   항상 이미 고정액이 들어 있는 용기에 표본을 넣습니다. 이를 통해 표본이 용기에 부착되는 것을 방지할 수 있습니다.
8. 공동을 열어 두어야 합니다.
   가능한 경우, 자연 공동이 있는 속빈 기관 또는 표본은 고정액이 즉시 접근할 수 있도록 열어 두어야 합니다.
9. 일부 표본의 관류가 유리합니다.
   전체 기관 또는 작은 실험 동물의 혈관계 관류에 의한 고정은 탁월한 결과를 제공할 수 있습니다.
10. 두께가 중요합니다(최대 4mm).
    최적의 고정을 달성해야 하는 경우, 표본 또는 조직 슬라이스의 두께는 4mm를 초과하지 말아야 합니다.
11. 약간의 교반이 도움이 됩니다.
    고정액에 담근 첫 몇 분 동안 표본을 가끔씩 부드럽게 교반(휘저어 섞기)하는 것이 침투에 도움이 될 것입니다.
12. 적절한 부피가 중요합니다(최소 20:1).
    고정 반응의 일부로 유효 성분이 고갈 될 수 있기에, 여분의 고정액이 필요합니다.
13. 충분한 시간을 허용합니다.
    고정액은 표본의 가장 치밀한 부분의 중심까지 침투한 후, 고정의 화학 반응이 발생해야 합니다.
14. 실온이 최선입니다.
    초기 고정은 실온(20°C)에서 가장 잘 이루어집니다.

필수 사항 3: 올바르게 조제된 고정액 선택

15. 고정액은 적절한 품질의 시약으로 조심스럽게 조제해야 하며, 명시된 경우 신선해야 합니다.
    시약의 품질에 따라, 고정의 품질이 나빠질 수 있습니다. 일부 조제된 고정액은 불안정하기에(예: Helly 액), 사용 직전 조제해야 합니다.
16. 고정액 내에 수령한 표본을 확인하고 필요한 경우 고정액을 교체해야 합니다.
    의심스러운 품질의 고정액에 고정된 표본을 수령하는 경우, 신선한 고정액으로 교체합니다. 이는 결과를 개선시킬 수 있습니다.
17. 고정액은 한 번만 사용해야 합니다.
    표본이 세포와 조직 조각을 고정액에 배출하여 후속 표본을 오염시킬 수 있습니다. 또한 고정 반응 동안 성분이 고갈됩니다.
18. 금속 뚜껑을 삼갑니다.
    일부 고정액은 부식성이 강하고 금속(예: 수은염)을 공격할 것입니다.
19. 고정 후 적절히 취급해야 합니다.
    일부 고정액의 경우 처리 전 표본을 물로 세척해야 하거나(예: Zenker 또는 Helly), 일부 다른 요건이 존재할 수 있습니다(70%가 넘는 알코올 농도의 완충액에서 인산염이 침전될 수 있습니다).
20. 모든 고정액은 독성이고 자극제입니다.
    고정액이 고정하기 위해서는 독성이어야 하며 정도가 다를지라도 자극제일 가능성이 높습니다. 고정제 사용자는 누구나 잠재적인 위험을 알고 있어야 합니다.

다음 표는 고정 및 고정액 시리즈의 네 번째 부분에서 언급한 각 고정액의 파라핀 처리 출발점을 보여줍니다.

처리 출발점 및 고정 후 기법

(특정 조직화학 절차에 때때로 권장된 바와 같이) 고정액의 온도가 올라가거나 내려가는 경우, 다양한 조직 성분에서 발생하는 화학 고정 반응 속도와 같이 표본으로의 확산 속도가 영향을 받게 됩니다. 온도가 올라가면 고정 프로세스가 빨라집니다. 특히 장시간 지속되는 경우, 과도한 열은 세포를 손상시키고 상당한 표본 수축과 경화를 야기할 수 있습니다.

냉동미세절단기가 광범위하게 사용되기 전, 동결 마이크로톰을 사용하여 동결 절편을 준비하기 전 소량의 표본을 비등 포르말린에 신속하게 고정하는 것이 표준 관행이었습니다. 이 프로세스는 절편을 제작할 수 있는 표본을 생성했으나, 종종 마이크로톰 전문가를 허용되지 않는 수준의 포름알데히드 증기에 노출시킬 뿐만 아니라, 보통의 매우 가변적인 현미경 결과를 보였습니다.

오늘날 대부분의 실험실은 고정액 온도가 올라가는 경우 직원들이 생성된 증기로부터 일정 정도 보호를 받을 수 있는 장소에서 처리기에 표본을 넣은 후에만 상온에서 일차 표본 고정을 실시합니다. 37°C~45°C의 온도가 일반적으로 사용됩니다.

처음에 큰 표본(3 mm가 넘는 두께)을 고정하는 데 고온 고정액을 사용하는 또 다른 문제는 표본 외부가 빠르게 고정되는 반면, 고정액이 블록 중심으로 침투하는 데 상당한 시간이 걸릴 수 있어 이 부위가 제대로 고정되지 않거나 전혀 고정되지 않을 수 있다는 것입니다. 그 후 블록은 표본의 내부와 비교해 외부에 다른 형태 및 염색 특성이 있는 과장된 “구역” 고정 효과를 보입니다. 이러한 이유로 일부 실험실에서는 마이크로파 고정을 사용합니다.

1970년에 조직 고정 수단으로서 마이크로파 가열이 처음 보고되었습니다. ¹이 때부터, 이 목적 및 항원 회수, 가속 절편 염색과 같은 다른 목적을 위해 조직병리학에서 마이크로파 오븐 사용이 증가해 왔습니다.

이 단계에서는 화학 고정제를 사용하지 않습니다. 또는 표본을 완충 포르말린 또는 일부 다른 고정제에 넣은 후,
이후 단계에서 고정제의 고정 작용을 돕기 위해 마이크로파를 조사할 수 있습니다(“마이크로파 지원 고정”^{2, 3}이라고 함⁴).

이 후자의 경우, 마이크로파 조사는 조직이 고정액에 있는 동안 실행할 수 있으며, 이 경우 독성 증기 발생으로 인한 일부 위험이 있을 수 있습니다. 또는 마이크로파 단계를 위해 조직을 다시 식염수 또는 완충제로 옮겨 담습니다.

^5-10어떠한 경우이든, 마이크로파 지원 고정이 발생하려면 고정액이 조직 내에 있어야 합니다. 마이크로파 지원 고정은 일차 마이크로파 고정보다 훨씬 더 흔히 사용됩니다.

글리옥살을 포함하는 비교적 낮은 독성의 전매 고정액이 마이크로파 지원 고정에 사용하도록 개발되었습니다.

마이크로파는 가정용 및 과학용 마이크로파 오븐에서 마그네트론이 생성하는 비이온화 방사선의 일종입니다.
2.5GHz 주파수에서, 물 또는 단백질 극성 곁사슬과 같은 이극성 분자가 초당 25억 주기로 교번 자기장에 노출될 때, 이는 순간 열을 발생시키는 능력이 있습니다.
조직 고정 동안 마이크로파 에너지가 열을 발생시키는 속도는 오븐의 파워 설정과 파워 출력, 보존 용액의 양과 성격, 조성, 용기(카세트 포함) 형태와 수, 용기 교반 또는 이동, 고정하는 표본 수, 부피 및 치수를 포함한 여러 인자에 따라 결정됩니다.
Kok와 Boon에 따르면, 2.5GHz 마이크로파는 4cm 깊이를 초과하는 조직에 거의 영향을 미치지 않으며, 일차 마이크로파 고정을 위해 조직 슬라이스 두께는 3cm를 초과하지 말아야 합니다.
마이크로파 조사 후 즉시 이를 2mm로 얇게 잘라 70% ⁴에탄올에 넣어야 합니다.마이크로파 지원 고정을 위해 Leong은 처음에 마이크로파 처치 전 포르말린에 고정시킨 조직으로부터 2mm 두께 슬라이스를 준비할 것을 제안합니다.
¹¹마이크로파 고정에 관여하는 많은 변수로 인해, 기법의 모든 측면을 완전히 표준화하고(일관적인 표본 치수 포함), 마이크로파 오븐을 올바르게 보정하며, 고정 단계를 수행하는 직원이 결과에 영향을 미칠 요인을 완전히 이해하는 것이 중요합니다.^11-13

열은 조직 고정 동안 마이크로파 효과를 책임지는 주요 요인으로 간주됩니다.
확산 속도 증가 외에도, 열은 분자 역학을 증가시키고 화학 반응을 가속화할 것입니다. 알데히드 고정액에서 과합체의 이량체와 단량체로의 분해, 고분자 수소 결합의 장-유도 변형, 양성자 터널링, 결합수 방해를 포함한 마이크로파가 미칠 수 있는 다른 영향에 대한 상당한 논의가 있었습니다.¹¹
일차 마이크로파 고정을 위해 표본 내에서 60°C를 초과하는 온도를 달성해야 하는 것처럼 보이지만, 보다 낮은 온도가 마이크로파 지원 고정에 허용될 수 있습니다.^{11, 14}