H&E 기초 4부: H&E 문제 해결

절편 은 우수한 염색 효과를 얻기 위한 필수 요건인 경우가 많습니다. 두껍고 얇은 절편, 금, "많은" 조직, 수조의 부유물 모두 효과적인 조직 염색에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 요소입니다.

두껍고 얇은 절편은 대부분 마이크로톰이 균일하게 회전하지 않아 절단 스테이션에서 작업이 정확하게 수행되지 않은 경우에 생성됩니다. 현재 상당수의 실험실에서는 마이크로톰을 사용한 자동 절편으로 신체 부상을 줄일 뿐만 아니라 일관되고 균일한 절편 슬라이드를 제공하고 있습니다.

가는 금 절편 팽창은 일반적으로 조직 처리와 관련이 있습니다. 가는 금은 조직이 과도하게 처리되거나 탈수된 데 따른 결과이며 절편 "팽창"은 조직이 부족하게 처리되거나 침윤된 결과입니다. 혈관 내 적혈구 세포를 보면 과도하게 처리된 조직의 또 다른 지표를 쉽게 알 수 있습니다.

물을 사용하면 슬라이드에서 불필요한 에오신을 원활하게 제거할 수 있으므로 에오신의 분별제로 물이 자주 사용됩니다. 탈수 알코올과 처음 100% 알코올에는 에오신을 제거하고 더 분별할 수 있는 충분한 양의 물이 포함될 수 있습니다. "물 또는 희석 알코올" 단계가 너무 많으면 에오신 음영이 옅어지고 세포질 구조가 약하게 염색됩니다.

염색 중에 단계 간 이월 현상(carryover)으로 인해 에오신에 이어 알코올에 물이 들어갈 수 있습니다. 시약을 자주 교체하지 않으면 수분 함량이 계속 늘어나 커버슬립 이전에 자일렌의 수분 함량이 높아집니다. 이처럼 자일렌에 과도한 수분이 계속 함유되면 조직에서 에오신이 스며나올 수 있으며 슬라이드에서 흐린 분홍색으로 나타납니다. 이러한 요소는 물에 의해 자일렌이 눈에 띄게 오염되지 않더라도 발생할 수 있습니다.

자일렌에 수분이 스며드는 원인에는 이월 현상만 있는 것이 아닙니다. 자일렌이 수분에 의해 오염되는 속도는 대기 습도의 영향을 받을 수 있습니다.

지리적 위치에 따라 수질이 중요한 변수가 될 수 있습니다. 플루오르화, pH 또는 다른 미네랄 함량은 조직이 염색되는 방식뿐만 아니라 염료 수명에도 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어 헤마톡실린은 약산성이므로 기본 pH 수돗물은 헤마톡실린의 pH 수치를 올려 효과를 저하시킬 수 있습니다. 수돗물 수질이 나쁘거나 가변적이면 초순수(DI)를 사용하는 것이 좋습니다. 이때 초순수 수압이 플랫폼 염색기에 충분한지 확인해야 합니다.

냉동 조직은 염색하기 매우 어려운 표본입니다. 타이밍이 매우 중요하며 병리학자들이 수술 의료진의 요구에 신속하게 대응할 수 있도록 염색 시간을 단축시켜달라는 요구가 계속되고 있습니다. 즉, 염색의 품질과 속도의 균형점을 찾기가 어려울 수 있다는 의미입니다.

개인적으로 경험한 가장 큰 요소 중 하나는 냉동 조직 절편과 관련 없는 고르지 않은 염색입니다. 가장 큰 이유는 고정 작업을 서두르고 염색 전에 슬라이드를 헹궜기 때문입니다. 절편 과정에서 냉동 조직을 지지하는 데 사용되는 매체는 수용성이어야 하며 표본에서 제거되어야 합니다. 제거는 염색 전에 표본에서 파라핀을 제거하는 것과 동일합니다. 이 매체는 파라핀 왁스처럼 균일한 염료 침투를 방해할 수 있습니다. 또한 왁스와 마찬가지로 염색 후 슬라이드에 매체 잔여물이 남아 있지 않을 가능성이 놓습니다. 염색 중에 매체를 제거하기 때문입니다.

일반적으로 실험실 연구원이 표본을 채취하지 않으므로 표본 채취 담당자를 교육하는 것이 매우 중요합니다. 표본을 채취할 때 거즈, 페이퍼 타월, 면봉 또는 다른 매개 도구를 사용하면 조직 내 수분이 도구로 이동하여 표본이 건조해질 수 있습니다. 이러한 요소는 생검에서 가장 흔히 나타나며 특히 같은 채취 장치를 사용하여 동일한 환자로부터 표본 여러 개를 채취하는 경우에 발생합니다. 이 경우 채취 장치를 포르말린으로 헹구면 환자가 위험해질 수 있으므로 통기성이 없는 물질을 사용하여 장치에서 조직을 제거해야 합니다. 염분을 사용하여 장치의 조직을 헹궈 다른 용기로 옮길 수도 있습니다. 이 방법을 사용하면 채취한 표본에서 수분이 제거되지 않습니다.

올바르게 고정하려면 표본을 채취하고 즉시 고정액에 담가야 합니다. 포르말린은 실험실에서 가장 일반적으로 사용되는 고정액이며 핵을 세부적으로 파악하는 데 효과적입니다. 그러나 포르말린은 특히 보관과 사용 기한에 있어 주의 깊게 취급해야 합니다. 포르말린이 직사광선에 노출되면 용액의 pH가 변경되어 조직 환경이 산성화될 수 있습니다. 고정액 산성화가 조직에 미치는 두 가지 주된 영향은 다음과 같습니다.

1. 조직 바깥쪽 가장자리의 그을림
2. 과도한 조직 건조

그을림은 표본의 바깥쪽 가장자리 모양이 달라져 "불에 탄" 것처럼 보이는 경우입니다. 이러한 변화는 시약이 표본에 올바르게 침투되는 것도 방해합니다. 표본 바깥쪽에 있는 단백질이 시약 침투와 수분 제거를 방해하는 차단막을 만들기 때문입니다.

산성 강도에 따라 조직이 과도하게 건조 될 수도 있습니다. 포르말린 강도가 걱정될 경우 새 시약을 사용하면 조직 손상 위험을 줄일 수 있습니다.

조직 처리기가 계속 진화하는 것처럼 처리 기법도 진화해야 합니다. 처리 프로토콜 시간은 처리 효율성을 향상시켜 환자 요구 사항이 충족되도록 더욱 간소화되고 있습니다. 따라서 모든 표본에 동일한 프로토콜을 적용하는 것은 이제 더 이상 타당한 방법이 아닙니다. 야간 프로토콜을 적용하는 작은 표본의 경우 과도하게 탈수되어 절편이 어려워집니다. 물을 적시는 방법이 도움이 될 수 있지만 조직에 과도한 균열이 생기는 경우가 많습니다. 생검에 적합한 프로토콜을 적용하는 큰 표본의 경우 충분하게 탈수되지 않아 적절한 처리가 완료될 때까지 절편하지 못할 수 있습니다.

핵 거품(bubbling)은 핵 내 단백질이 응고될 때 나타납니다. 이러한 요소는 표본이 고열에 노출되어 올바르게 고정되지 않은 경우에 자주 발생합니다. 고정액의 pH 수치가 높아도 거품이 생길 수 있습니다. 극한의 환경에서 작은 물방울 주위에 단백질이 응고되면 비눗방울과 같은 모양이 나타납니다. 아쉽게도 이는 한 번 발생하면 제거될 수 없습니다.

절편 후 물기가 남아 있는 슬라이드를 오븐에 넣어 건조시키는 경우가 많습니다. 고온(예: 70°C)에서는 절편 아래 수분이 조직을 통해 빠르게 증발합니다. 이러한 증발로 인해 단백질이 응고되며 비눗방울 모양의 아티팩트가 발생합니다. 이러한 거품을 방지하려면 오븐 온도를 낮추거나 슬라이드를 오븐에 넣기 전에 어느 정도 공기 중에서 건조시키면 됩니다.

부유물도 자주 발생합니다. 부유물 원인을 판별하기 위해서는 조직과 관련하여 슬라이드에서의 위치를 파악하면 됩니다. 부유물이 조직 표본과 같은 초점 평면에 있으면 블록에 오염 물질이 있을 가능성이 높습니다(육안 검사 또는 포매가 원인).

일반적으로 외부 오염(예: 수조 또는 염색 시약 내)의 경우 조직 위 또는 조직 평면 바깥쪽에 부유물이 나타납니다. 두 가지 경우 모두 육안 검사/포매 부위를 깨끗하게 유지하고 깨끗한 수조를 사용하며 시약을 자주 교체하거나 여과시키면 부유물 생성을 효과적으로 방지할 수 있습니다.

염색기와 시약 용기를 정기적으로 세척하지 않으면 박테리아와 곰팡이가 생길 수 있습니다. 장비 유지 관리 방법은 제조업체 지침을 참조하십시오. 표백제는 대부분의 용도에 적합하지만 장비에서 문제를 일으킬 수 있습니다.

H&E 염색에서 색소로 보일 수 있는 물질이 인체에서 생성될 수 있다는 사실에 유의해야 합니다. 멜라닌, 혈철소(오래된 적혈구 세포), 염증 조직 파편이 혼란을 일으킬 수 있습니다. Zenker와 같은 고정액도 세포 외 색소를 만들 수 있습니다. 이 경우 병리학자가 포르말린 이외의 물질로 표본을 고정했다는 사실을 알지 못하면 문제가 될 수 있습니다. Zenker(중크롬산칼륨/염화수은)는 독성으로 인해 대부분 사용 금지되어 있지만 여전히 자체적으로 만들어 사용하는 곳도 있습니다. 염색 결과에 영향을 미칠 수 있는 특이한 고정 환경을 기록해 둡니다.

조직학 실험실에서는 지금까지 다양한 방법을 사용하여 슬라이드에 조직을 점착했습니다. 과거에는 전하를 띈 슬라이드의 경우 일반 절편에 너무 비싸다고 인식되어 실험실에서는 알부민이나 기타 단백질을 사용하여 슬라이드에 조직을 점착했습니다. 과거는 물론 현재까지도 수조 점착제에 상용 시약을 사용하고 있습니다. 문제는 일관성입니다. 작업자마다 수조를 채우는 방식은 물론 수조에 사용하는 점착제 양도 다릅니다. 점착제를 넉넉하게 사용하는 사람도 있고 소량만 사용하는 사람도 있어 백그라운드 염색을 관리하기가 쉽지 않습니다.

점착제에는 자체 제한이 없으며(예: H&E의 백그라운드 염색) 면역 조직 화학 염색을 방해할 수도 있습니다.

최근에는 전하를 띈 슬라이드를 쉽게 구할 수 있고 실험실 염색에도 잘 사용할 수 있어 백그라운드 또는 점착제와 관련된 다른 문제가 발생할 가능성이 줄어들고 있습니다. 모든 슬라이드를 일관적으로 취급하므로 슬라이드 간 차이가 크지 않습니다.

그렇다면 양성 전하를 띈 슬라이드와 점착제를 함께 사용하면 조직이 훨씬 더 잘 고정될까요? 그렇지 않습니다. 두 방법 모두 조직에서 이온을 끌어온다는 특성이 있습니다. 전하를 띈 슬라이드와 점착제를 함께 사용하면 각각 서로의 특성을 상쇄시키므로 양성 전하를 띈 슬라이드가 일반 유리 슬라이드로 변하게 됩니다.

자일렌 대체제가 차츰 널리 사용되고 있으며 실험실 안전을 더욱 강화할 수 있습니다. 이러한 대체제에는 물에 대한 낮은 내성과 같은 제한 사항이 없습니다. 제조업체에서 권장하는 호환 봉입제를 사용해야 할 수도 있습니다. 일반적인 자일렌 기반 봉입제와 호환되지 않는 경우도 있기 때문입니다.

자일렌 대체제가 일반적으로 더 안전하지만 취급 시 자일렌과 같은 수준의 주의가 필요합니다. 폐기물 처리 법규는 지역에 따라 다르지만 자일렌 대체제를 항상 자일렌과 같은 방법으로 폐기해야 하며 하수구에 흘려 보내서는 안 됩니다. 이러한 시약은 탄화수소 물질로 환경에 유해합니다. 또한 일반적으로 냄새가 강해 대체제를 사용하는 실험실에서는 냄새를 없앨 수 있는 환기 시설을 구비해야 합니다.

에탄올처럼 염색을 향상시킬 수 있는 다른 알코올 제품도 시중에서 판매되고 있습니다. 메탄올, 이소프로필 알코올(IPA), 플렉스(Flex)가 가장 일반적이며 에탄올을 사용하는 것보다 경제적입니다. 플렉스 알코올 제조업체는 에탄올, 메탄올, IPA를 다양한 비율로 혼합하므로 가능한 경우 성분 비율을 확인해야 합니다. 염색장비에 특정 시약을 사용하는 데 있어 궁금한 점이 있으면 장비 제조업체에 호환성을 문의하십시오. 무엇보다 염색을 내부적으로 검증했는지 확인합니다.

H&E 슬라이드 상태를 양호하게 유지하기 위한 가장 간단한 방법은 시약을 자주 교체하는 것입니다. 대부분의 제조업체에서는 표본을 교체해야 하는 슬라이드 수에 대한 정보를 제공하고 있습니다. 이 데이터를 참조하여 실험실에 가장 적합한 방식을 확인합니다. 시약을 매일 교체하는 것이 더 바람직하다면 매일 교체합니다

현재 대부분의 실험실에서는 일종의 염색 플랫폼을 사용하고 있습니다. 염색 플랫폼을 사용하면 전문가가 다른 작업을 처리할 수 있을 뿐만 아니라 염색 일관성도 유지할 수 있습니다. 그러나 실험실의 다른 모든 장비와 마찬가지로 염색 성공에 가장 중요한 것은 유지 관리와 품질 관리입니다. 제조업체 규격에 따라 염색장비를 세척 및 유지 관리해야 합니다.

대규모 실험실의 경우에는 유지 관리 주기를 줄이는 것이 바람직할 수 있습니다. 어떠한 경우든 항상 교육을 이수한 전문 엔지니어가 장비에서 기계 작업을 수행해야 합니다. 대부분의 기업에서는 사용자가 서비스를 요청할 수 있는 서비스 플랜을 제공하고 있으며 일반적으로 예방적 유지 관리도 예약하고 있습니다. 장비의 인증 자격을 제시하지 않고 서비스를 제공하려고 하는 기업을 유의해야 합니다. 외부 공급업체로부터 잘못된 서비스를 받으면 정비를 전혀 하지 않는 것처럼 장비가 손상될 수 있습니다.

어려운 일로 보이지는 않지만 놀랍게도 다수의 실험실에서 장비 관련 교육에 시간을 거의 투자하지 않고 있습니다. 정기적인 역량 평가와 웨비나 또는 다른 외부 교육을 통해 사용자들에게 자신의 기량을 새롭게 다질 수 있는 기회를 제공하면 염색에 대한 기초 지식을 갖게 됩니다.

물론 최적의 염색이 무엇인가에 대한 모든 사람의 의견이 일치할 수는 없습니다. 가장 쉬운 방법은 약간의 시차를 두어 여러 프로토콜을 수용하는 데 사용하는 염색을 프로그래밍하여 병리학자들에게 몇 가지 선택안을 제시하는 것입니다. 염색 시간을 알 수 있는 간단한 코드 시스템을 만들 수도 있지만 병리학자들은 자신들의 눈으로 본 사실에 입각하여 대응해야 합니다.

염색강도를 조절할 때는 간단한 방법이 가장 좋습니다. 효과적인 조절 범위는 다음과 같습니다.

• 헤마톡실린 +/-30초
• 에오신 Y +/-15초

일반적으로 한 번에 하나만 조절하는 것이 좋습니다. 이 시간은 미세한 변화에 충분한 수준입니다. 필요한 경우 더 공격적으로 변화를 줄 수 있습니다. 헤마톡실린이 너무 옅으면 시간을 1분 이상 늘리면 됩니다. 그러나 대개는 위 시간이 적합한 조절 범위입니다.

주의: 연구 대상에 따라 헤마톡실린 또는 에오신을 조절하는 것만으로도 상대 물질이 더 밝거나 연하게 나타날 수도 있습니다.