고정 및 고정액(3) – 일반적인 알데히드 이외의 고정제

아크롤레인 또는 아크릴 알데히드(H₂C=CH.CHO)는 포름알데히드와 유사한 방식으로 거대분자와 반응하여 가역적 교차결합을 형성합니다. 아크롤레인은 포름알데히드보다 교차결합을 더 많이 생성하는 것으로 나타났습니다. 아크롤레인은 이중 결합을 통해 지방산과 반응합니다. 아크롤레인은 신속하게 조직에 침투하고 극도의 반응성이 있지만, 사용 시 불쾌하고(강력한 눈물 작용제), 알칼리성 pH에서 불안정하며, 중합체를 쉽게 형성하기 때문에 광범위하게 사용되지는 않습니다. 이는 주로 효소 조직화학 및 식물 재료의 고정에 사용되어 왔습니다. 고정 후, 조직 내 잔류 카르보닐기는 PAS 와 같은 기법을 적용하면 배경 염색을 야기합니다. ^1-3

글리옥살 또는 디포르밀(CHO.CHO)은 포름알데히드와 유사한 방식으로
반응하여 유사한 형태학적 양상을 생성하는 이작용성(bifunctional) 알데히드입니다. 각 알데히드기는 잠재적으로 반응성이며 교차결합이 형성될 수 있습니다. 글리옥살은 일상적인 작업뿐만 아니라 특히 마이크로파 고정에 에도 적용할 수 있는 여러 전매 고정제의 주요 성분입니다. 증기압이 극도로 낮아서 실온에서 거의 증기를 생성하지 않기 때문에 포름알데히드보다 사용 시 덜 위험하다고 하여 일반적으로 “포르말린 대체재”로 불립니다. 자극성이며 피부 접촉 시 민감할 수 있지만, 현재는 발암물질로 분류되지는 않으며, 잠재적 돌연변이 유발 효과에 대한 경고가 제공됩니다. 글리옥살은 불안정하고 가역적인 방식으로 DNA 형성 부가물과 반응합니다. 생분해성이라고 알려져 있으며, 따라서 포르말린보다 폐기가 용이합니다.^{2, 4, 5}

사산화오스뮴(OsO4)은 밀봉된 앰플에 공급되는 고독성, 휘발성, 결정질 고체입니다. 휘발성으로 인해 안구 결막과 비점막을 쉽게 고정시킬 수 있기 때문에 흄후드 아래에서 매우 조심스럽게 취급해야 합니다.⁶ 극성 및 비극성 용매에서 용해되며 단백질의 곁사슬과 반응하여 교차결합을 형성합니다. 사산화오스뮴은 지질을 안정화하는 극소수 고정제 중 하나이므로, 그 가장 중요한 고정 반응은 지질과 인지질의 불포화 결합과 관련된 반응입니다. 고정 중에 사산화오스뮴은 더 낮은 단계의 불용성인 흑색 산화물로 환원되며, 조직, 특히 막에 침착됩니다. 오스뮴은 중금속이므로 전자를 흩뿌려 전자현미경 영상에 전자밀도를 추가합니다.^{7, 8} 또한 광학현미경 수준에서 지질(특히 말이집 신경섬유)을 보여주기 위한 일괄(en bloc) 염색에 사용할 수도 있습니다. 일반적으로 약 1% w/v로 전자현미경검사 및 신경섬유 갈래검사(teased nerve fibre preparation)를 위한 특수 이차 고정제로 사용됩니다.⁹

카르보디이미드류(RN=C=NR’)는 다양한 작용기와 반응하는 매우 반응성 높은 화합물입니다. 특정 유형의 카르보디이미드, pH, 온도, 또는 촉매를 선택함으로써 반응을 향상시키거나 선택적으로 차단할 수 있습니다. 고정 반응의 결과 중 하나로 펩티드 결합이 형성될 수 있으며 이후 프로테아제를 사용하여 선택적으로 이 결합을 파괴할 수 있으므로, 이러한 화합물 군은 일반 조직학뿐만 아니라 면역조직화학법에서도 사용 가능성이 있는 것으로 여겨집니다. 카르보디이미드류는 이미 면역원 조제에 사용되고 있습니다.²

디이미도에스테르류는 단백질의 아미노기에 교차결합하는 수용성 화합물로, 전자현미경검사와 면역조직화학법에 사용되어 왔습니다. 클로로-S-트리아지드류(염화시아누르)는 침샘 점액소 및 면역형광법에 사용되어 왔습니다. 디이소시아네이트류는 단백질에 형광 태그를 부착하는 데 사용되어 왔으며, 디에틸피로카보네이트(Diethylpyrocarbonate, DPC)는 트립토판 잔기와 반응하며 동결건조 조직에 대한 증기상 고정제로 사용되어 왔습니다. 적절한 완충액에서는 작은 표본에 대한 고정제로 제안되었습니다. 말레이미드류는 단백질과 일부 교차결합을 형성하는 것으로 보이고, 벤조퀴논은 아민, 아미노산 및 펩티드와 반응하며 면역조직화학법을 위해 내분비 조직에서 펩티드를 고정하는 데 사용되어 왔습니다.^{2, 3}

염화수은(HgCl₂)은 조직 고정에 사용된 첫 번째 시약 중 하나였습니다. 오래된 문헌에서는 “승홍(corrosive sublimate)”이라고 불렸는데, 이는 이 물질이 해부 기구의 스테인리스강을 포함한 금속과 반응하는 부식성 화학물질이기 때문입니다. 조직을 고정하는 기전이 완전히 밝혀지지는 않았지만, 아민, 아미드, 아미노산 및 설프하이드릴기와 반응하는 것으로 알려져 있으며, 후자는 시스테인과의 반응에서 두드러지고, 이 반응에서 교차결합을 생성하는 것으로 여겨집니다. 염화수은은 강력한 단백질 응고제로서, 조직을 산성 염료 사용 시 강한 염색을 나타내는 상태가 되도록 만듭니다. 이 물질은 핵산의 인산염 잔기와 반응하며 핵단백질을 효과적으로 고정합니다. 염화수은이 B-5 및 Helly 고정액과 같은 조제된 고정제, 고품질 핵 보존이 필요할 때 권장되는 고정제(예: 골수 트레핀)의 주요 성분으로 사용되는 것은 이러한 이유 때문입니다.

염화수은을 함유하는 고정제를 사용하는 것에는 몇 가지 단점이 있습니다. 염화수은의 부식성 특성과는 별개로, 수은은 독성이 매우 높고 피부를 통해 흡수될 수 있으며 축적되는 독극물입니다. 대부분의 국가에는 수은과 수은 함유 화합물의 폐기에 관한 엄격한 규칙이 있습니다. 염화수은을 함유한 고정제로 고정하는 동안, 수은의 결정성 또는 무정형 녹갈색 인공 색소가 조직 내에 무작위로 침착됩니다. 염색 전 처리 과정이나 절편화 중에 요오드(Lugol 요오드)로 표본을 처리하면 요오드화수은이 생성되며 이는 세척을 통해 조직에서 제거할 수 있습니다. 이후 티오황산나트륨으로 처리하면 잔류 요오드가 제거됩니다. 염화수은 기반 고정제는 침투력이 낮은 경향이 있으며, 고정이 장기화되는 경우 조직이 매우 단단해지고 처리 중에 수축되기 쉽습니다.^{6, 7}

최근 몇 년 동안, 아연염 및 바륨염을 포함한 다수의 금속염이 염화수은의 대체재로 도입되었습니다. 염화아연과 황산아연은 적합한 것으로 상당히 널리 인정되어 왔으며, 현재 여러 독점 B-5 대체재를 이용할 수 있습니다.⁶

황산아연(ZnSO₄)과 염화아연(ZnCl₂)은 다수의 조제 및 전매 고정제에서 염화수은의 대체재로 사용되며, 이 중 조직 처리기에서 문제를 일으키는 것으로 보고된 염화물보다 황산염이 잠재적으로 부식성이 더 낮기 때문에 황산염이 더 많이 사용됩니다.⁶ (파트4 참조). 염은 10% 포르말린 용액(수성 또는 알코올성, 완충 또는 비완충)에 약 1% 농도로 첨가되지만, 조제 중에 아연 또는 완충염의 침전과 관련하여 일부 문제가 보고된 바 있습니다. 아연염은 다양한 조직과 아미노, 카르복실, 설프히드릴을 포함한 다양한 기와 반응하여 가역적 반응 생성물을 형성하며, 이들 중 일부는 시트르산염 또는 EDTA 세척을 통해 제거할 수 있습니다. 아연은 염화수은과 유사한 방식으로 특히 핵의 고정 및 염색을 강화한다고 알려져 있습니다. 포르말린 단독 사용과 비교했을 때 면역 반응성을 보존하는 데 이점이 있다고 여겨짐에 따라 일부 항원결정인자에 대한 항원 복구의 필요성이 없습니다. 아연염은 수은염보다 독성이 훨씬 낮으며 아연 용액 폐기 시 아무 문제도 발생하지 않습니다^{2, 6}.

피크르산 또는 트리니트로페놀(C₆H₂(NO₂)은 밝은 황색 결정질 물질로, 건조 물질의 충격 또는 가열에 의한 폭발 위험을 피하기 위해 반드시 물에 젖은 상태로 보관해야 합니다. 밀봉용기에 보관하고 정기적으로 점검하여 습기가 있는지 확인해야 합니다.¹⁰ 건조해 보이는 경우 증류수를 첨가할 수 있습니다. 고정 시에는 항상 다른 제제와 함께 사용합니다(파트 4 – Bouin 용액 및 Hollande 용액 참조). 고정제의 성분이라는 점 외에도, 피크르산은 여러 염색에서 산성 염료로 사용됩니다(예: 근육 염색용 Van Gieson 용액). 피크르산은 고정 중에 조직을 노란색으로 만들며, 산성 특성이 있으므로 처리 전에 70% 에탄올로 조직에서 잔류 피크르산을 씻어내야 합니다. 처리 후 조직 블록에 잔류 피크르산이 남아 있는 경우, 조직의 염색 특성에 영향을 미쳐 시간이 지남에 따라 악화될 것입니다.

피크르산은 단백질의 이온화 가능한 곁사슬의 전하를 변화시키고 정전기 및 수소 결합을 방해하는 응고성 고정제입니다. 이 물질는 단백질의 염기성기와 결합해 염(피크르산염)을 형성하여 응고를 일으킵니다. 지질 또는 대부분의 탄수화물을 고정하지 못하는 것으로 보이나, 글리코겐을 보존하는 데 사용하는 고정제의 성분으로 권장됩니다. 피크르산은 핵산을 가수분해할 수 있으므로 DNA 또는 RNA가 보여야 하는 경우에는 사용을 피해야 합니다. 피크르산은 표본 내의 작은 칼슘 침착물을 용해시킬 것입니다. 피크르산 함유 시약으로 고정된 조직을 처리하는 동안에는 상당한 양의 수축이 발생합니다.^{6, 7, 11}

중크롬산칼륨(K₂Cr₂O₇)은 pH < 3.4~3.8에서 사용하지 않는 한 비응고제로 작용하지만, 이 pH 범위에서는 크롬산처럼 응고제로 반응합니다. 이 물질은 여러 복합 고정제의 성분입니다(파트 4 – Zenker 용액 및 Helly 용액 참조). 고정 반응은 단백질의 산화와 함께 환원된 크롬산염 이온의 상호작용을 통해 이루어지는 것으로 여겨지며, 이로 인해 약간의 교차결합이 형성되는데, 그 정도는 고정액의 pH에 의해 결정됩니다. 크롬 이온은 단백질의 카르복실 및 히드록실 곁사슬과 반응하는 것으로 보고됩니다. 이 물질은 아미노기를 이용 가능한 상태로 만들기 때문에 산성 염료로 염색하는 것이 좋습니다. 크롬산염은 불포화 지질과 반응하여 불용성으로 만드는데, 이러한 이유로 미토콘드리아에 대한 양호한 고정제로 간주됩니다. 일반적으로 처리 알코올과 크롬산염의 반응에 의한 불용성 크롬산염 아산화물의 형성을 피하기 위해, 크롬산염 함유 고정액에 고정된 조직은 처리 전에 물로 철저히 세척할 것이 권장됩니다. 전통적으로 중크롬산염 함유 고정제는 내분비 조직의 “크롬친화성” 과립을 함유한 아민에 대한 조직화학법에 사용되었습니다.^{6, 7, 11}

에탄올(CH₃CH₂OH)과 메탄올(CH₃OH)은 단백질을 변성시키는 응고제로 간주됩니다. 이 물질들은 조직 환경에서 물을 대체하여 소수성 및 수소 결합을 파괴하여 단백질의 내부 소수성 기를 노출시키고 3차 구조와 물에서의 용해도를 변화시킨다. 메탄올은 에탄올보다 물의 구조에 더 가깝기 때문에 에탄올은 메탄올보다 소수성 영역과 더 강하게 상호작용합니다. 고정은 에탄올의 경우 50~60%의 농도, 메탄올의 경우 >80%의 농도에서 시작됩니다. 에탄올은 때때로 글리코겐을 보존하기 위해 사용되지만 핵 및 세포질 세부상의 왜곡을 유발합니다. 메탄올은 혈액 도말의 고정액으로 흔히 사용되고 95% 에탄올은 세포검사 도말의 고정액으로 사용되지만, 두 알코올 모두 조직 검체의 고정액으로 사용될 때는 대개 다른 시약과 함께 사용됩니다.^{3, 7, 12}

아세톤(CH₃COCH₃)은 알코올과 유사한 작용을 하며 조직 처리, 특히 작은 표본의 신속한 수동 처리를 위한 고정제 및 탈수제로 사용되어 왔습니다. 아세톤은 효소의 조직화학적 입증을 위한 고정에 널리 권장되며, 이 경우 일반적으로 저온(4°C)에서 사용됩니다. 아세톤은 조직을 매우 취약하게 만들 수 있는 신속한 작용을 하는 효과적인 지질 용매입니다. 아세톤은 휘발성과 가연성이 매우 높으므로 일반적으로 자동 조직 처리기에는 사용되지 않습니다.^{3, 7}

아세톤은 씰과 장비의 기타 구성품에 악영향을 미칠 수 있으므로 일부 조직 처리기에는 사용해서는 안 됩니다.

아세트산(CH₃COOH)은 핵산과 작용하는 응고제이지만, 일반적으로 단백질을 고정시키지는 않습니다. 아세트산은 핵산 손실을 예방하고, 콜라겐을 부풀리는 점을 이용해 에탄올과 같은 다른 성분으로 인한 수축에 대항하기 위해 복합 고정제에 포함됩니다. 아세트산은 매우 빠르게 침투하지만 아세트산 함유 고정제는 적혈구를 용해합니다.^{3, 7}