Die Kunst des Schneidens gefrorener Gewebe

Als praktizierender Pathologe kann ich mir keine anspruchsvollere Aufgabe vorstellen, als die Erstellung und Interpretation von Gefrierschnitten. Es liegt am Pathologen, der nur mit ein paar Fläschchen Farbe und einem Kryostaten bewaffnet ist, eine kleine Gewebeprobe zu bewerten und auf Basis dessen zu entscheiden, wie eine laufende Operation des Patienten fortgeführt wird. Das mag übertrieben klingen, ist aber harte Realität – einschließlich der damit einhergehenden Verantwortung. Letztere sorgt dafür, dass der Pathologe während seiner gesamten Laufbahn Bedenken und Vorsicht niemals ablegen kann. Um die notwendigen Antworten auf die gestellten Fragen geben zu können, müssen bestimmte Prozesse fehlerfrei ablaufen. Dazu gehört die initiale Untersuchung der Probe, die Auswahl relevanter Gewebeabschnitte, die Einbettung, das Schneiden selbst und die anschließende Färbung der Präparate. Nur so werden Objektträger produziert, die mit hoher diagnostischer Sicherheit zu interpretieren sind. Bei jedem dieser Schritte können Prozessfehler dazu führen, dass die Probe unverwertbar wird.

Dieser Artikel beschäftigt sich mit dem Prozess der Gewebeeinbettung in Vorbereitung auf die Gefrierschnitterstellung. Das Einbetten von Gewebe gilt mancherorts als unkompliziert, was auch stimmen mag, wenn es um einfache Proben geht, deren räumliche Orientierung kaum eine Rolle spielt. Allerdings gibt es viele Proben, die nur dann Antworten liefern, wenn sie innerhalb des Blocks exakt ausgerichtet sind.

In herkömmlichen Kryostaten werden Gewebeproben in der Vorbereitung auf die Gefrierschnitterstellung eingebettet, indem sie „face up“, also mit der schnittrelevanten Seite nach oben, auf einen Gewebehalter gelegt und mit einem Einbettmedium bedeckt werden. Der Gewebehalter, der auch „Blockhalter“ genannt wird und die Probe trägt, wird dann auf eine Gefrierleiste gelegt. Um den Gefriervorgang zu beschleunigen, wird schließlich ein Kühlkörper auf die Probe gesetzt, der gleichzeitig eine oberflächenglättende Funktion erfüllt. Dieses System hat mehrere Nachteile, die zu erheblicher Frustration führen können. Es ist zweckdienlich in Situationen, in denen ein großes Gewebevolumen verfügbar ist und eine präzise Ausrichtung kein Problem darstellt. Hier kann eine ausreichend große Probe eingebettet und so weit getrimmt werden, bis der Histologe mit der Schnittfläche zufrieden ist. Leider ist das immer seltener der Fall und bei der Mehrzahl der Gewebeproben, die heute verarbeitet werden, ist es entscheidend, bei minimalem Trimmen eine optimale Schnittfläche zu erreichen. Wird darauf keine Rücksicht genommen, entstehen Präparate, die stark getrimmt werden müssen, an Gewebe verlieren und entsprechend minderwertig sind. Zusätzliche Artefakte können aus der Anwendung des recht schweren Kühlkörpers resultieren, über den Druck auf die Probe ausgeübt wird. Diese Methode der Gewebebearbeitung vermittelt bestenfalls eine vage Vorstellung von dem, was mit der Paraffineinbettung möglich ist.

Bei der Arbeit mit winzigen Proben und dünnen Biopsiekernen werden die Grenzen dieser Technik noch deutlicher. Dann ist es eine echte Herausforderung, alles Gewebe, das beurteilt werden soll, in einem Schnitt darzustellen, ohne wesentliche Probenteile beim Trimmen zu verlieren. Weitere Schwierigkeiten ergeben sich, wenn hauchdünne und schwer zu handhabende Proben in präziser Ausrichtung eingebettet werden müssen. Solche Proben in gefrierendes Einbettmedium einzubringen und einzeln auszurichten, während man über den Kryostaten gebeugt ist, ist nicht nur unbequem, sondern vor allem wenig praktikabel.

Erfahrene Histotechniker haben eine Vielzahl von Techniken und behelfsmäßigen Apparaturen entwickelt, um bessere Ergebnisse zu erzielen. Eine solche Technik besteht in der Verwendung vorgefrorener Blockhalter, die mit einer dünnen Schicht Einbettmedium überdeckt sind. Damit steht eine flache Oberfläche zur Verfügung, auf die die Proben aufgebracht werden können, was den Rillen und Gittern der Blockhalter vorzuziehen ist, die auf eine maximale Haftung abzielen. Andere Ansätze beschreiben, wie das Gewebe auf eine gefrorene Oberfläche gepresst und so geglättet wird, bevor es mit der schnittrelevanten Seite nach oben auf dem Blockhalter eingebettet wird. Histotechniker, die mit Präparaten aus der Mohs-Chirurgie arbeiten, schneiden ihre Hautproben so ein, dass sie sich entspannen und leichter abgeflacht werden können.

Die Gefrierschnitterstellung ist anstrengend und wird es noch mehr, wenn man unter Druck steht, möglichst schnell ein Ergebnis zu liefern. Die Belastung wird noch größer, wenn gleichzeitig mehrere Proben aus verschiedenen Eingriffen eintreffen und bearbeitet werden müssen. Unter Verwendung herkömmlicher Systeme in modernen Kryostaten kann es 90 Sekunden oder länger dauern, bis ein Block gefroren ist, und weil es gilt, den richtigen Moment abzupassen, um den Kühlkörper aufzusetzen, muss der Gefrierprozess aufmerksam verfolgt werden. Damit das schneller geht, hat man sich mancherorts für Alternativen zum schnellen Gefrieren von Gewebeproben entschieden, wie zum Beispiel das Eintauchen in flüssigen Stickstoff oder andere supergekühlte Flüssigkeiten. Dabei entstehen zwar weniger Gefrierartefakte, aber die Präzision leidet.

Eine Handvoll innovativer Köpfe haben die Grenzen all dieser herkömmlichen Methoden überdacht und Lösungen vorgeschlagen, wie sich Gewebeproben in der Gefrierschnittvorbereitung optimal einbetten lassen. Zu diesen Lösungen zählen auch spezielle Geräte, von einfachen Abflachungsvorrichtungen bis hin zu komplexen und aufwendigen Instrumenten, die mit der Zielstellung entwickelt wurden, die Probenausrichtung zu erleichtern. Bisher hat keines dieser Produkte den Weg in die Herzen der großen Kryostathersteller gefunden.

Dieser Artikel beschreibt ein System zur Einbettung von Geweben in der Gefrierschnittvorbereitung, das auf einer einfachen Apparatur und simplen Techniken beruht. Die Proben werden mit der schnittrelevanten Seite nach unten eingebettet, wofür der Terminus „face down“ verwendet wird. Dazu werden sie in auf Gefriertemperatur gekühlte Vertiefungen gegeben, die in Stahlleisten gefräst sind und als Einbettformen dienen. Obwohl das System der Paraffineinbettung ähnlich ist, hat es dieser gegenüber einen wesentlichen Vorteil. Es macht sich die Physik zunutze, die Gewebe an gefrorenem Stahl haften lässt. Diese Eigenschaft erleichtert das Einsetzen der Proben in die Vertiefungen und macht es einfacher als die Ausrichtung derselben in erstarrendem Paraffin. Die daraus entstehenden Vorteile, wie sie in diesem Artikel beschrieben werden, umfassen Planbarkeit, Präzision, Geschwindigkeit und weniger Gewebeverlust sowie leichte Erlernbarkeit, Praktikabilität und Bequemlichkeit.

Die in diesem Artikel beschriebene Apparatur wurde vom Autor entwickelt, der zudem Präsident von Pathology Innovations LLC in Wyckoff, NJ, USA ist. Sie besteht aus einer Reihe von Komponenten, die nachfolgend beschrieben werden.

Stahlleiste mit Einbettformen:

Die Einbettung erfolgt in Vertiefungen, die in die Oberfläche von 1-Zoll-starken Stahlleisten eingearbeitet sind (Abbildung 1A). Nach Abkühlung auf Kryostattemperatur werden diese recht dicken Leisten zu einem leistungsstarken Kühlelement, in dem die Blöcke schnell gefrieren. Die Einbettformen sind mit abgeschrägten Wänden, abgerundeten Kanten und polierten Oberflächen versehen, was die finale Entnahme des Blocks erleichtert. Aktuell verwendet der Autor quadratische Einbettformen, deren Durchmesser 18, 24 und 30 mm an der Basis betragen. Je nach Anspruch lassen sich ähnliche Vertiefungen in unterschiedlichen Größen und Tiefen fräsen. Die Einbettleisten werden möglichst tief im Kryostaten gelagert, wo die Temperaturen am niedrigsten sind, und für die Einbettung an eine höhere und besser zugänglichere Position gebracht. In vielen Kryostaten kann zu diesem Zweck eine kleine Bank installiert werden. Eine Kryostattemperatur von -23 bis -27 °C, bei Arbeit unter Raumtemperatur, eignet sich bestens zum schnellen Einfrieren.

Blockhalter

Die Blockhalter sind mit über Kreuz verlaufenden, scharfkantigen Rillen versehen, um die Haftung zu maximieren und den Block gut halten zu können (Abbildung 1B). Darüber hinaus dringt das Einbettmedium in diese ausreichend breiten und tiefen Kanäle des kalten Blockhalters ein, der daher bei Gefriertemperatur gelagert werden kann, was den Gefrierprozess beschleunigt. Die über Kreuz verlaufenden Kanäle ermöglichen das Ablaufen von überschüssigem Einbettmedium, sodass der Halter flach auf die Außenränder der Einbettform gepresst werden kann. Die Halter sind aus Edelstahl gefertigt, wodurch ihre Gefrierleistung und Nutzungsdauer maximiert werden, und können bequem in einem Behälter tief im Kryostaten gelagert werden. Sie funktionieren am besten, wenn sie kalt zum Einsatz kommen. Allerdings können sie auch warm verwendet werden, wenn der nachfolgend beschriebene Überhalter-Gefrierblock aufgesetzt wird. Blockhalter mit Schaft sind dafür am besten geeignet. Die Kraft des Antippens wird über den Blockhalterschaft auf den Block in der Einbettform übertragen, was schließlich zur Freigabe desselben führt. Diese Blockhalter sind kompatibel mit den meisten Kryostaten gängiger Marken und können unter Verwendung eines Adapters auch in vielen anderen Kryostaten genutzt werden.

Überhalter-Gefrierblöcke

Die rechteckigen Gefrierblöcke, die auf den Blockhalter aufgesetzt werden, bestehen aus Stahl und funktionieren als Wärmefalle (Abbildung 1C). Sie sind so konzipiert, dass sie auf den Schaft des Blockhalters passen. Der Gefrierblock dient auch als Auslösetool. Wird er vorsichtig, aber bestimmt angeklopft, kommt es zur Spaltung der Adhäsionsebene, die den Block in der Einbettform festhält. Weiterhin erfüllen diese Gefrierblöcke die Funktion einer gut zugänglichen, flachen Gefrierfläche, wie sie für die unten beschriebene Oberflächenkorrektur benötigt wird.

Objektträger zum Probeneinsatz

Der dünne, transparente Objektträger zum Probeneinsatz besteht aus Vinyl und dient dazu, das Gewebe exakt auszurichten und in die Einbettform zu übertragen (Abbildung 1D). Das Gewebe wird auf das Ende des transparenten Objektträgers gelegt und zwar so, dass die schnittrelevante Oberfläche nach unten zeigt. Hier ist sie vollständig einsehbar. Wenn nötig, kann die Position der Probe noch korrigiert werden. Genau diese Fläche wird auf den Boden der Einbettform gesetzt, sie wird eingebettet und schließlich geschnitten.

Einbettungsfach

Dieses abnehmbare Einbettungsfach ist für die Installation an der Vorderwand unterhalb der Öffnung des Kryostaten vorgesehen, wo es bequem und ergonomisch zugänglich ist (Abbildung 1E). Derartige Fächer sind in verschiedenen Größen erhältlich, sodass sie in den allermeisten Geräten verwendet werden können. Das abgebildete Fach bietet Platz für drei Einbettleisten, in denen insgesamt zwölf Blöcke bearbeitet werden können. In Kryostaten, in denen kein Fach installiert werden kann, ist es möglich, die Einbettleisten auf einer anderen, bequem zugänglichen flachen Oberfläche abzustellen, z. B. auf dem Pinselhalter.

Ausrichtung des Gewebes auf dem Objektträger zum Probeneinsatz

1. Benetzen sie den Objektträger zum Probeneinsatz mit einer dünnen Schicht Einbettmedium (Abbildung 2A).
2. Platzieren Sie das einzubettende Gewebe mit der schnittrelevanten Seite nach unten auf dem Ende des Objektträgers (Abbildung 2B).
3. Schauen Sie sich das Gewebe durch den transparenten Objektträger von unten an. Korrigieren Sie die Position der Proben, insofern das notwendig ist (Abbildung 2C).

Einbringen des Gewebes in die Stahlleisten mit Einbettformen

1. Ziehen Sie das Gewebe etwa einen Millimeter über den Rand des Objektträgers zum Probeneinsatz.
2. Setzen Sie diesen überhängenden Probenabschnitt an der gewünschten Stelle auf den Boden der Vertiefung auf (Abbildung 2D).
3. Ziehen Sie den Objektträger zum Probeneinsatz vorsichtig unter der Probe hervor, sodass diese auf dem Boden der Einbettform zu liegen und haften kommt. Falls Ihr Gewebe eine noch präzisere Ausrichtung erfordert, nutzen Sie die Möglichkeit, dessen Lage zu korrigieren, während Sie den Objektträger zum Probeneinsatz langsam herausziehen.

Befüllung der Einbettform mit Einbettmedium

Füllen Sie die Form bis zu ihrem maximalen Fassungsvermögen mit dem Einbettmedium, sodass über ihrer Oberkante ein Meniskus erkennbar wird (Abbildung 2E).

Aufsetzen des Blockhalters auf die Einbettform

Setzen Sie den Blockhalter sofort flach auf die Einbettform auf (Abbildung 2F). Eventuell vorhandenes überschüssiges Medium läuft durch die Rillen im Halter ab.

Aufsetzen des Gefrierblocks auf den Blockhalter

Setzen Sie den Überhalter-Gefrierblock auf den Schaft des Blockhalters (Abbildung 2G).

Dieser Schritt ist zwingend, wenn Sie mit 30-mm-Einbettformen oder ungekühlten Blockhaltern arbeiten.

Gefrierphase

Optimale Gefrierbedingungen sind gegeben, wenn Einbettleisten und Blockhalter zum Einsatz kommen, die in einem Kryostaten bei -24 °C gelagert werden und damit vollständig gekühlt sind.

In Abhängigkeit vom Durchmesser der Einbettform können folgende Werte als Richtwerte zur Gefrierzeit angenommen werden: 18-mm-Form, 20 Sek.; 24-mm-Form, 35 Sek.; 30-mm-Form, 60 Sek. 

Entnahme des Blocks

Ein vorsichtiges, aber dennoch kräftiges Antippen des Gefüges aus Gefrierblock und Blockhalter lockert den Block in der Einbettform, sodass er problemlos entnommen werden kann (Abbildung 2H und 2I).

Objektträger zum Probeneinsatz

Die Objektträger zum Probeneinsatz verjüngen sich zur Spitze hin und sind mit unterschiedlich breiten Spitzen erhältlich. Dabei wird die Spitzenbreite basierend auf der Probengröße und der Größe der Einbettform, in der das Gewebe platziert werden soll, ausgewählt. Die Transparenz des Objektträgers erlaubt es, die Gewebefläche einzusehen, die auf dem Boden der Einbettform und damit an der Front des fertigen Blocks zu liegen kommt. So kann die Position der Proben kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert werden.

Damit lässt sich sicherstellen, dass beispielsweise der Resektionsrand oder die Epidermis einer Hautprobe wie gewünscht ausgerichtet sind. Auch kann Gewebe aufgestellt werden. Während der Objektträger vorsichtig unter der Probe hervorgezogen wird, wird diese in ihre abschließende Position geführt.

Eine dünne Schicht Einbettmedium verbessert die Haftung und Positionierung des Gewebes und sorgt später für eine mühelose, integre Entnahme des Blocks. Gleichzeitig dient das Einbettmedium als Gewebestütze. Es verhindert ein Verrutschen der Proben auf dem Objektträger und erleichtert deren Manipulation. Wenn zu viel Einbettmedium verwendet wird, ergibt sich eine dickere Schicht aus gefrorenem Medium über dem eingebetteten Gewebe. Insbesondere bei Proben, die absolut flach eingebettet werden müssen, z. B. bei Nadelbiopsien, kann das zum Problem werden. Abbildung 3 zeigt ein kleines Kunstwerk, für das eine extrem flache Einbettung nötig war. Die „Proben“ sind in diesem Fall gefärbte Sesamsamen. Sie wurden in einer ausgesprochen dünnen Schicht Einbettmedium in die Einbettform gesetzt. Nur so ließ sich erreichen, dass sämtliche Samen auf ein und derselben Ebene zu liegen kamen.

Wenn kein Risiko einer Kreuzkontamination besteht, können mehrere Proben auf einem einzigen Objektträger platziert und von diesem aus in die Einbettformen überführt werden. Wird beispielsweise Gewebe aus einem großen Tumor verarbeitet, können vier Proben, die jeweils einen Quadratzentimeter messen, in eine 30-mm-Einbettform gesetzt werden. In den Gefrierschnitten, die schließlich aus diesem Block erstellt werden, lässt sich recht viel Gewebe auf einmal beurteilen. Wenn es allerdings darum geht, beispielsweise Lymphknotenproben von vier verschiedenen Stellen einzubetten, müssten jedoch separate Objektträger zum Probeneinsatz verwendet werden, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.

Einbringen des Gewebes in die Einbettformen

Die Positionierung und Ausrichtung des Gewebes in der Einbettform sollte bedacht werden, bevor die Probe auf das Metall aufgesetzt wird. Wenn eine große Probe eingebettet werden soll, muss das Aufsetzen an einem Punkt geschehen, von dem aus sich auch der übrige Probenteil in der Form ausbreiten lässt. Geht es beispielsweise um die Einbettung eines Gewebestreifens von zwei Zentimetern Länge in einer 30-mm-Einbettform, muss der initiale Berührungspunkt nahe am Rand gewählt werden. Für die Einbettung vier quadratischer Proben mit einer Kantenlänge von einem Zentimeter in derselben 30-mm-Einbettform ist es notwendig, jede Probe in einer Ecke zu platzieren und so genügend Platz für die übrigen zu lassen (Abbildung 4). Wie immer bei der Vorbereitung von Gewebe für die Gefrierschnitterstellung sollte die Ausrichtung der Proben zur Klinge in Betracht gezogen werden. So ist man sich weitgehend einig, dass die Epidermis von Hautproben im Idealfall senkrecht auf die Klinge trifft.

Das Hervorziehen des Objektträgers unter dem Gewebe ist ein kritischer Schritt, der Fingerspitzengefühl erfordert und maßgeblich zum Endergebnis beiträgt. Bei Proben, die keinerlei besondere Ausrichtung erfordern, kann der Objektträger in einer zügigen Bewegung entfernt werden. Sorgfalt und Akribie sind hingegen notwendig, um Gewebe, das einer bestimmten Orientierung bedarf, den Vorgaben entsprechend zu platzieren. Wenn es die Form der Probe zulässt, sollte ihr kritischster Rand zuerst aufgesetzt werden. Der Objektträger kann dann langsam unter der Probe hervorgezogen werden. Es empfiehlt sich, dabei eine Pinzette als Führungshilfe zu nutzen. Wenn ein eingefärbter Rand untersucht werden soll, ist besonders darauf zu achten, dass dieser Rand zuerst den Boden der Einbettform berührt. Dann kann der übrige Probenteil dem Anspruch nach positioniert werden. Bei der Bearbeitung dünner Hautstreifen aus der Mohs-Chirurgie ist große Sorgfalt walten zu lassen, um eine flache Einbettung und vollständige Visualisierung der Epidermis zu gewährleisten. Proben, die eine zusätzliche Abflachung erfordern, können mit der Unterseite einer abgewinkelten Zange vorsichtig niedergedrückt werden. Tubenartige Proben wie Harnleiter lassen sich mühelos vertikal ausrichten, wozu das Gewebe nur ganz leicht auf den Metallboden der Einbettform aufzusetzen ist. Auch dünne Gewebestreifen können so in die Einbettform geführt werden, dass sie hochkant stehen bleiben. Membranöse Proben können bereits auf dem Objektträger zum Probeneinsatz gerollt oder gefaltet werden, um von dort unter Erhaltung ihrer Position in die Einbettform gebracht zu werden. Mit ein wenig Vorstellungsvermögen und Fantasie ergeben sich endlose Möglichkeiten, die gewünschten Einbettungsziele zu erreichen.

Umgang mit Flüssigkeiten

Flüssigkeiten und sehr weiche Proben, wie z. B. Material aus der endometrialen Kürettage und Empfängnisprodukte, können mit einem Plastiklöffel oder einem Spatel abgenommen und feinsäuberlich und ohne Quetschungsartefakt in die Einbettform überführt werden (Abbildungen 5A und 5B). Für die Verarbeitung von sehr blutigen Flüssigkeiten empfiehlt sich das Einrühren von ein paar Tropfen Einbettungsmedium, damit eben jener blutige Anteil beim Schneiden weniger auseinanderbricht. Abbildung 6 zeigt, welch hohe Präzision in der Handhabung von Flüssigkeiten mit diesem System erreichbar ist

Befüllung der Einbettform mit Einbettmedium und Aufsetzen des Blockhalters

Nur wenn sich ein Meniskus aus Einbettmedium über der Einbettform hervorwölbt, kann dieses in die oberflächlichen Rillen des Blockhalters eindringen und so für eine feste Verbindung zum Block sorgen. Der Blockhalter sollte nach dem Befüllen der Einbettform so schnell wie möglich auf diese aufgesetzt werden. Dazu wird er fest auf die Einbettleiste und damit auf die Ränder der Einbettform aufgedrückt. Eventuell vorhandenes überschüssiges Medium läuft durch die Rillen im Halter ab.

Gefrierzeiten

Die empfohlenen Gefrierzeiten sind ungefähre Angaben, die der Erfahrung des Autors entsprechen und voraussetzen, dass Einbettleisten und Blockhalter vollständig gekühlt zum Einsatz kommen. Längere Zeiten werden erforderlich, wenn sich die Einbettleisten erwärmen, die Blockhalter ungekühlt verwendet werden oder sehr dicke Proben durchfrieren müssen. Der Anwender entwickelt schnell ein Gefühl dafür, wann der Block fertig ist. Nach Entnahme der Blöcke sollten die Einbettleisten unverzüglich in die Tiefe des Kryostaten zurückgelegt werden, um auch für die nächste Runde mit optimaler Temperatur zur Verfügung zu stehen. Ähnliches gilt für die Blockhalter, die so bald wie möglich gereinigt, getrocknet und zurück in den Kryostaten gelegt werden sollten, um bestmöglich zu funktionieren. Innerhalb eines Kryostaten herrschen beachtliche Temperaturunterschiede zwischen den oberen und tiefen Bereichen. Das Einbettungsfach wird recht weit oben im Kryostaten installiert, um dem Anwender die Ausführung dieser entscheidenden feinmanuellen Aufgaben zu erleichtern. Werden Einbettleisten, Blockhalter oder Blöcke für längere Zeit auf dem Fach belassen, erwärmen sie sich über die optimalen Arbeitstemperaturen hinaus.

Parallele Bearbeitung mehrerer Proben

Das System eignet sich hervorragend zur gleichzeitigen Verarbeitung mehrerer Gewebeproben. Die Objektträger zum Probeneinsatz sollten im Voraus vorbereitet werden, um die Proben ohne Verzögerung in der gewünschten Reihenfolge in die Einbettformen einbringen zu können. Die Blockhalter lassen sich problemlos beschriften, nachdem sie auf der Einbettform platziert wurden. Bei Verwendung vollständig gekühlter Blockhalter können die Blöcke in etwa 15 Sekunden aus der Einbettform genommen werden, bevor sie vollständig durchgefroren sind. Der Gefrierprozess kann auf jeder beliebigen Gefrierfläche abgeschlossen werden, während bereits an den nächsten Blöcken gearbeitet wird. In der Zeit, die zum Füllen der vier nebeneinander liegenden Einbettformen benötigt wird, gefrieren die ersten Blöcke hinreichend, um auf eine anderweitige Gefrierfläche verlegt zu werden. Die frei werdenden Einbettformen können sofort neu gefüllt werden. Wenn der Anwender so weit ist, die Blöcke zu schneiden, sind sie mit Sicherheit vollständig durchgefroren. In weniger als zwei Minuten lassen sich so acht Blöcke anfertigen.

Entnahme des Blocks

Ein vorsichtiges, aber kräftiges Antippen des Gefüges aus Gefrierblock und Blockhalter lockert den Block in der Einbettform, sodass er problemlos bewegt werden kann. Beim Antippen kommt es zur Spaltung der Adhäsionsebene, die sich zwischen dem kalten Stahl und dem gefrorenen Medium bildet. Wenn Sie versuchen, den Block am Schaft des Blockhalters herauszuziehen, werden Sie besonders in den großen Einbettformen auf Haftungswiderstand stoßen. Ein kräftiges Antippen löst den Block in der Form und hebt den Widerstand auf, sodass er leicht entnommen werden kann.

Der entnommene Block erscheint auch dann intakt, wenn er nicht vollständig durchgefroren ist, sofern das Einbettmedium unter dem Blockhalter Zeit hatte, an diesem anzufrieren.

Wenn sich der Blockhalter vom Block löst, liegt das entweder an einer unzureichenden Füllung der Einbettform oder einer zu hohen Temperatur des Halters, auf den kein Gefrierblock aufgesetzt wurde. Das Problem lässt sich leicht beheben, indem eine zusätzliche Schicht Einbettmedium aufgetragen und ein neuer Blockhalter aufgesetzt wird.

Oberflächenkorrektur

Die Technik zur Oberflächenkorrektur wird angewandt, um Unregelmäßigkeiten, Löcher und Spalten auszugleichen. Solche Defekte können bei der Anfertigung von Blöcken nach herkömmlichen Methoden oder dem hier beschriebenen System auftreten (Abbildung 7). Das geschieht, wenn sich das Einbettmedium während des Gefrierprozesses kontrahiert und dabei Leerräume entstehen zwischen der Schicht, die das Gewebe überzieht, und jener, die den Wänden der Einbettform anliegt. Dabei handelt es sich um rein oberflächliche Defekte, die spätestens mit den ersten Trimmschnitten entfernt werden. Allerdings ist das bei sehr kleinen Proben mitunter nicht möglich und dann ist eine Oberflächenkorrektur vorzuziehen. Das Füllen von Löchern, die sich aus Blasen im Einbettmedium ergeben oder auf Defekte zurückzuführen sind, die durch Klammern gesetzt wurden, macht es einfacher, den Gewebeverlust zu reduzieren und einen vollständigen Schnitt zu erhalten. Abbildung 7A zeigt ein Beispiel für Unregelmäßigkeiten in der Oberfläche, wie sie bei der Anfertigung von Gefrierblöcken auftreten können. Sie lassen sich mit geringem Aufwand auffüllen. Die Oberflächenkorrektur wird wie folgt durchgeführt:

1. Füllen Sie wesentliche Oberflächendefekte mit geringen Mengen Einbettmedium (Abbildung 7B).
2. Drücken Sie die soeben behandelte Oberfläche unverzüglich auf eine Gefrierfläche (Abbildung 7C).
3. Ziehen oder klopfen Sie den Block von der Oberfläche ab (Abbildung 7D).

Das Medium kann als Tropfen aus der Flasche appliziert oder unter Verwendung eines kleinen Spatels, der Finger oder sonstiger Hilfsmittel aufgetragen werden. Wenn Sie bereits mit dem Trimmen begonnen haben, ist das auch kein Problem. Die Oberflächenkorrektur kann ebenso erfolgen, während sich der Block im Halter befindet, indem das Medium auf die defekte Oberfläche aufgebracht und dann mithilfe des Überhalter-Gefrierblocks geglättet wird. Dieselbe Technik kann verwendet werden, um den Block mit einer „Knautschzone aus Einbettmedium“ zu versehen. Das ist unter Umständen nötig, wenn sich ein kritischer Probenteil zu nahe am Rand befindet, um einen guten Schnitt zu erstellen.

Ausrichtung des Gewebes zur Klinge

Dies ist ein äußerst wichtiger Aspekt in der Vorbereitung von Gefrierschnitten. Mit dem in diesem Artikel beschriebenen Einbettsystem ist es recht leicht, Gewebeproben in den Einbettformen so auszurichten, dass sie in einem bestimmten Winkel auf die Klinge treffen. Basierend auf umfangreicher Erfahrung gelten die folgenden Faustregeln:

1. Fett sollte das letzte sein, was auf die Klinge trifft. Wenn möglich sollte es allein und nicht gemeinsam mit anderen Geweben auf die Schneide treffen (Abbildung 8A und B). Fett ist bei Temperaturen, die sich für das Schneiden der meisten anderen Gewebe empfehlen, zu weich, um gute Schnitte zu erreichen. Wenn es in diesem Zustand vor den anderen Geweben auf die Klinge trifft, kann es verschmieren und die folgenden Schnitte verderben. Derartige Probleme lassen sich vermeiden, wenn entsprechende Vorkehrungen getroffen werden, um Fett als letztes oder allein auf die Klinge treffen zu lassen. Dann stört es andere Gewebe kaum. Wenn ich Schwierigkeiten habe, einen guten Schnitt zu erstellen, weil Fett in der Schnittfläche erscheint, drehe ich den Blockhalter, um das Fett zu meiden.
2. Der kritischste Probenrand sollte senkrecht oder diagonal zur Klinge verlaufen und nicht der erste oder letzte Gewebeabschnitt sein, der auf die Schneide trifft. Betrachten Sie einen Schnitt als einen Prozess, der einen Anfang, eine Mitte und ein Ende hat. Am Anfang besteht die Gefahr, dass sich die Probe einrollt oder durch den Pinsel beschädigt wird, und möglicherweise gibt es Probleme mit der Dicke, weil das Gewebe nur zögerlich erfasst wird. Dabei können Artefakte entstehen. Ebenso kann es am Ende zum Einrollen kommen, oder zu einer übermäßigen Gewebedehnung. In der Mitte hingegen läuft das Gewebe glatt über die Klinge. Artefakte sind weniger wahrscheinlich und die Chance auf saubere, qualitativ hochwertige Schnitte ist am größten. Hier soll der essenzielle Probenabschnitt liegen, wie z. B. ein eingefärbter Rand.
3. Mit Epithel oder Mukosa überzogene Gewebe wie Haut, Verdauungsorgane, Harnblase, Uterus und Zervix sollten so orientiert werden, dass diese Deckschicht senkrecht zur Klinge verläuft. Beim Einbetten einer ovalen Hautprobe tendiert jener Abschnitt, der zuerst auf die Klinge trifft, dazu, sich einzurollen. Das Schema in Abbildung 9 zeigt einen Ansatz zur Einbettung einer solchen Hautprobe, der sicherstellt, dass die Längsränder (2-5) zuletzt in Kontakt mit der Klingenkante kommen.

Ich bin sicher, dass Sie mit ein wenig Übung selbst zahlreiche Vorschläge zu diesem Thema machen können. In der Praxis lernt es sich immer noch am besten. Der Punkt ist, die Schnittqualität als Funktion dessen zu betrachten, wie das Gewebe auf die Klinge trifft. Das hier beschriebene System lässt Sie Ihre Proben ganz nach Ihren Vorstellungen ausrichten.

Dieses System zur Face-down-Einbettung von Geweben bringt alle Vorzüge mit sich, die aus der Paraffineinbettung in der Routinehistologie bekannt sind, und gewährt eine gute Zugänglichkeit der schnittrelevanten Probenabschnitte. Die Eigenschaft des Gewebes, sofort am kalten Stahl zu haften, macht den hier beschriebenen Prozess in vielerlei Hinsicht einfacher als die Paraffineinbettung. Daraus ergeben sich wesentliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden zur Gewebeeinbettung in der Gefrierschnittvorbereitung, einschließlich Planbarkeit, Präzision, Geschwindigkeit und weniger Gewebeverlust sowie leichter Erlernbarkeit, Praktikabilität und Bequemlichkeit.

Die Zeitersparnis in mehreren Einzelschritten summiert sich zu einer deutlichen Beschleunigung des gesamten Prozesses auf. Die Herstellung einzelner Blöcke nimmt wesentlich weniger Zeit in Anspruch, als dies bei der Verwendung von Gefrierleisten und Kühlkörpern der Fall ist, wie sie in den meisten Kryostaten angeordnet sind. In der hier beschriebenen Apparatur lassen sich kleine Blöcke in 20 Sekunden gefrieren, größere in einer Minute. Darüber hinaus erleichtert das System die parallele Präparation mehrerer Blöcke, was den durchschnittlichen Zeitaufwand pro Block und Probe weiter vermindert. Nach Füllung der Einbettformen mit Einbettmedium muss der Gefrierprozess nicht länger überwacht werden, um den Moment abzupassen, in dem der Kühlkörper aufzusetzen ist. Insbesondere in Situationen, in denen mehrere Proben aus verschiedenen OP-Sälen zu bearbeiten sind, schafft diese Tatsache wertvolle Freiräume. Schließlich müssen bei gegebener Probenzahl weniger Blöcke angefertigt werden, was sich ebenfalls positiv auf Arbeitslast und Zeitaufwand auswirkt: Vor allem in den 30-mm-Einbettformen können mehrere Proben auf einmal verarbeitet werden. Auf der anderen Seite erlauben diese großen Einbettformen die Erstellung übersichtlicher Panoramaschnitte. Ein weiterer Vorteil ist, dass sämtliche Blöcke aus den Einbettleisten flach und in etwa gleich dick sind, wobei der jeweilige Blockhalter annähernd parallel zum Gewebe anhängt. All das reduziert die Notwendigkeit zum Trimmen. Einerseits sind die Proben im Block optimal ausgerichtet, andererseits muss der Winkel, in dem der Blockhalter ansetzt, nicht aufwendig korrigiert werden, was sonst weiteres Trimmen und Gewebeverlust bedeuten würde.

Die Möglichkeit, unter Verwendung des hier beschriebenen Systems eine präzise planbare, flache Oberfläche des eingebetteten Gewebes bereitzustellen, ist der Schlüssel zu höchster diagnostischer Sicherheit. Wie bereits erörtert, erlaubt es das System dem Anwender, das Gewebe so auszurichten, dass dessen schnittrelevante Seite in einer flachen Ebene zu liegen kommt und damit leicht zugänglich wird. In der Vergangenheit wurden für die Face-down-Einbettung Einbettformen aus Kunststoff genutzt. Die hier verwendeten metallenen Einbettformen sind denen aus Kunststoff in der Hinsicht überlegen, als dass die Proben am gefriergekühlten Stahl haften. Eben jene Haftung am Boden der Vertiefung in der Einbettleiste erleichtert die exakte Positionierung des Gewebes. Die Blätter in Abbildung 10 wurden einfach aufrecht in einen Tropfen Einbettmedium gestellt. Dies lässt sich genauso gut mit einer hauchdünnen Gewebeprobe tun oder sogar mit einem Haar, das aufgestellt bleiben soll. Unabhängig voneinander können mehrere Proben in die jeweils gewünschte Position gebracht werden, um allesamt in einem optimalen Winkel auf die Klinge des Mikrotoms zu treffen.

Quetschungsartefakte, wie sie bei der Anwendung herkömmlicher Methoden durch die kühlkörperinduzierte Gewebekompression häufig auftreten, werden im hier beschriebenen System vermieden.

Die Positionierung der Proben in einer flachen Ebene an der Vorderseite des Blocks reduziert die Notwendigkeit zu Trimmschnitten signifikant. Der Weg zu einem vollständigen Schnitt, in dem beispielsweise ein Resektionsrand oder die Epidermis einer Hautprobe umfassend bewertet werden können, ist wesentlich verkürzt. Abbildung 11 zeigt einen Block mit 51 Mohnsamen, die in einer einzigen flachen Ebene getrimmt wurden. Stellen Sie sich einmal vor, Sie müssten statt 51 Mohnsamen zahlreiche samengroße Hirnbiopsien einbetten. Wie hoch sind Ihre Chancen, 51 Biopsien in einem Gefrierschnitt darstellen zu können, wenn Sie herkömmliche Methoden einsetzen? Und wieviel Material bliebe Ihnen zur Anfertigung von Dauerschnitten? Eine präzise und überaus flache Einbettung ermöglicht es, Probenmaterial für Dauerschnitte und damit zur Gefrierschnittkontrolle zu erhalten.

Die hier erläuterte Technik lässt sich leicht lehren und erlernen. Bereits mit minimaler Übung können Techniker und Auszubildende Proben vorbereiten, wie sie sich mit herkömmlichen Methoden nicht erreichen ließen. Auf der anderen Seite kann der Pathologe beruhigt sein, dass auch ein weniger erfahrener Mitarbeiter seine Objektträger optimal vorbereiten kann, weil sich aus der Einfachheit der Technik eine Qualitätsgarantie ergibt. Die Tatsache, dass Proben aller Art schnell und zuverlässig einzubetten sind, macht das System zu einer sicheren Wahl. Der Anwender weiß im Voraus, welche Seite der Probe an der Vorderseite des Blocks erscheint, was entscheidend zur Qualität der endgültigen Schnitte beiträgt.

Die Installation eines Einbettungsfachs im vorderen Bereich des Kryostaten, unterhalb seiner Öffnung, erlaubt mehr Fingerfertigkeit und Komfort beim Einbetten.

Die Funktionalität der verwendeten Apparatur lässt sich ganz einfach gewährleisten, indem diese im Kryostaten gelagert wird. Ihre Fertigung aus rostfreiem Stahl garantiert eine lange Nutzungsdauer, auch unter hoher Beanspruchung. Die einzigen potenziell entbehrlichen Komponenten des Systems sind die Objektträger zum Probeneinsatz aus Vinyl, die allerdings sehr preiswert sind. Vom Einbettmedium einmal abgesehen, müssen keinerlei teure Verbrauchsmaterialien bereitgestellt werden, wie beispielsweise flüssiger Stickstoff. Wenn ein Einbettungsfach installiert werden soll, müssen dazu lediglich zwei Schrauben in die Vorderwand des Kryostaten gesetzt werden. Diese Aufgabe sollte für das Wartungspersonal des Krankenhauses oder den Kryostattechniker kein Problem darstellen.

Der Wartungsaufwand beläuft sich auf das gelegentliche Auswischen der Einbettleisten mit alkoholbefeuchteter Gaze. Außer Frost finden sich nur selten Rückstände in den Einbettformen. Bei der Verarbeitung von sprödem nekrotischen Gewebe oder blutigen Flüssigkeiten können gelegentlich geringe Reste in der Vertiefung zurückbleiben. Im Allgemeinen sorgt die dünne Schicht Einbettmedium, die auf den Objektträger zum Probeneinsatz gegeben wird, für eine saubere Trennebene. Alle mikroskopisch kleinen Rückstände, die unbemerkt bleiben und somit auf den nächsten Block übergehen könnten, würden mit den allerersten Trimmschnitten entfernt.

Dieses System zur Face-down-Einbettung von Gewebeproben, aus denen Gefrierschnitte erstellt werden sollen, verwendet gefriergekühlte Einbettleisten und bietet wesentliche Vorteile bezüglich Planbarkeit, Präzision, Geschwindigkeit und Gewebeverlust sowie Erlernbarkeit, Praktikabilität und Bequemlichkeit. Das System lässt sich typenunabhängig und mühelos an die meisten Kryostaten anpassen. Zu seiner Anwendung genügt eine simple Apparatur, für die sich der Wartungsaufwand auf eine einfache Reinigung beschränkt.

Abbildungen