Eine Einführung in die Gewebeinfiltration

Mit dem Begriff der „Gewebeinfiltration“ wird jener Prozess bezeichnet, der fixiertes tierisches oder menschliches Gewebe in einen Zustand überführt, in dem es vollständig von einem geeigneten histologischen Wachs durchdrungen wurde, eingebettet und im Mikrotom geschnitten werden kann.

Die Gewebeinfiltration kann manuell erfolgen, also von Hand, aber wenn mehrere Proben verarbeitet werden müssen, ist es bequemer und vor allem viel effizienter, den Vorgang zu automatisieren und einen Gewebeinfiltrationsautomaten zu verwenden. Solche Automaten sind seit den 1940er Jahren¹ erhältlich und wurden stetig weiterentwickelt, sind heute wesentlich sicherer in der Anwendung, können größere Probenzahlen handhaben und schneller verarbeiten und liefern bessere Ergebnisse. Es gibt zwei Haupttypen von Infiltrationsautomaten: Auf der einen Seite stehen die halbgeschlossenen Automaten vom Gewebetransfer-Typ, bei denen die Proben im Gerät von einer Station zur nächsten bewegt und in die entsprechenden Flüssigkeiten eingetaucht werden. Im Englischen spricht man von „Dip-and-Dunk“-Automaten. Auf der anderen Seite gibt es die geschlossenen Infiltrationsautomaten, die nach dem Prinzip des Flüssigkeitstransfers arbeiten. Die Proben verbleiben während des gesamten Prozesses in ein und derselben Kammer, in die Flüssigkeiten nach Bedarf ein- und ausgepumpt werden. Die meisten modernen Geräte, die das Prinzip des Flüssigkeitstransfers anwenden, arbeiten zudem bei erhöhter Temperatur, nutzen eine effektive Flüssigkeitszirkulation sowie Vakuum- und Druckzyklen, um die Infiltration zu optimieren und zu beschleunigen.

Moderner geschlossener Gewebeinfiltrationsautomat

Die meisten Laborleiter sind sich der großen Bedeutung einer effektiven Gewebeinfiltration bewusst und vermitteln dies auch ihren Mitarbeitern. Es soll betont werden, dass ungeeignete Infiltrationsprotokolle und grundlegende Fehler, wie sie in der Reihenfolge der Reagenzien oder bei scheinbar simplen Aufgaben wie dem Auffüllen der Tanks passieren können, dazu führen mögen, dass Gewebeproben schlussendlich nicht geschnitten und daher nicht beurteilt werden können. Das ist unverzeihlich, wenn Sie mit Humangewebe arbeiten, aus dem eine Diagnose abgeleitet werden soll und das Sie nicht ersetzen können, weil die gesamte Probe aufgebraucht wurde. Kein Ersatz. Keine Diagnose. Aber ein Patient, der auf seine Ergebnisse wartet.

Wenngleich auch Gewebeinfiltrationsautomaten nicht vor mechanischen oder elektrischen Defekten gefeit sind, beruht der Großteil der Infiltrationsfehler, die zu einer irreversiblen Gewebeschädigung führen, auf menschlichem Irrtum. Deshalb kann der Wert einer angemessenen Aus- und Weiterbildung für diejenigen, die mit der Gewebeinfiltration beauftragt sind, nicht überbetont werden. Es sollte ihnen in jedem Moment bewusst sein, dass jeder einzelne Schritt zum Gesamtergebnis beiträgt und besondere Sorgfalt verdient.

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1. Eine frische Probe nehmen

Frische Gewebeproben können aus ganz verschiedenen Quellen stammen. Es sollte beachtet werden, dass das Gewebe während der Probenahme vom Patienten oder Versuchstier sehr leicht beschädigt werden kann. Die Proben müssen unbedingt schonend gehandhabt werden und sind so bald wie möglich zu fixieren. Im Idealfall findet die Fixierung direkt nach der Entnahme statt, z. B. im Operationssaal. Sollte dies nicht möglich sein, ist das Gewebe unmittelbar nach der Ankunft im Labor zu fixieren.

2. Fixierung

Die Probe wird in ein flüssiges Fixiermittel gegeben. Als Beispiel sei die Formaldehydlösung Formalin genannt. Fixiermittel werden auch als Fixative bezeichnet und dringen langsam in das Gewebe ein, wobei chemische und physikalische Prozesse ablaufen, die das Gewebe konservieren, härten und vor den negativen Einflüssen der anschließend eingesetzten Reagenzien schützen.² Die Anzahl der Reagenzien, die zur Fixierung verwendet werden können, ist recht überschaubar, da nur wenige Substanzen die notwendigen Eigenschaften besitzen. So dürfen sie beispielsweise die chemische Reaktivität bestimmter Gewebebestandteile nicht beeinträchtigen, damit diese anfärbbar bleiben.³ Formalin liegt meist in einer Phosphat-gepufferten Lösung vor und ist das gängigste Fixiermittel für die Konservierung von Geweben, aus denen schließlich Paraffinschnitte erstellt werden sollen. Im Idealfall sollten die Proben so lange im Fixiermittel liegen, bis dieses die Probe vollständig durchdrungen und jeden Teil des Gewebes erreicht hat, und zusätzlich eine weitere Zeit, in der die chemischen Reaktionen der Fixierung ihr jeweiliges Gleichgewicht erlangen. So ergibt sich die Gesamtfixierungszeit. Im Allgemeinen bedeutet das, dass für die Fixierung zwischen sechs und 24 Stunden vorzusehen sind. Die meisten Labore programmieren ihre Gewebeinfiltrationsautomaten so, dass die Proben während des ersten Verarbeitungsschritts im Gerät fixiert werden.

Nach der Fixierung kann vor allem bei größeren Proben eine weitere Sektion erforderlich sein, um untersuchungsrelevante Bereiche zu identifizieren. Proben, die bereit zur Infiltration sind, werden in adäquat beschriftete perforierte Körbe gelegt – in sogenannte Kassetten –, wo sie jederzeit identifizierbar bleiben, aber von anderen Präparaten getrennt sind. Die nötige Infiltrationszeit hängt von der Art und der Größe der Proben, dem jeweiligen Infiltrationsautomaten, den gewählten Lösungsmitteln und ihren Temperaturen und einer Reihe weiterer Faktoren ab. Das folgende Beispiel basiert auf einem sechsstündigen Protokoll, das im Leica PELORIS™ Gewebeinfiltrationsautomaten ausgeführt werden kann.

3. Entwässerung

Da geschmolzenes Paraffinwachs hydrophob und daher nicht mit Wasser mischbar ist, muss ein möglichst großer Anteil des Wassers aus der Probe entfernt werden, bevor sie mit Wachs infiltriert werden kann. Die Entwässerung erfolgt schrittweise, meist indem die Probe eine aufsteigende Alkoholreihe durchläuft. Dazu wird sie nacheinander in Ethanollösungen mit zunehmender Konzentration eingetaucht, bis reiner, wasserfreier Alkohol erreicht ist. Ethanol fungiert als Lösungsmittel, das in allen Proportionen mit Wasser mischbar ist, sodass das Wasser im Gewebe Schritt für Schritt durch den Alkohol ersetzt wird. Die allmähliche Entwässerung in der Alkoholreihe ist schonender, als es eine „Schockbehandlung“ in reinem Alkohol wäre, und hilft, die Verformung des Gewebes zu begrenzen.

Eine typische aufsteigende Alkoholreihe für Proben, die nicht dicker als 4 mm sind, sieht wie folgt aus:

1. Ethanol 70 %      15 Min.
2. Ethanol 90 %      15 Min.
3. Ethanol 100 %    15 Min.
4. Ethanol 100 %    15 Min.
5. Ethanol 100 %    35 Min.
6. Ethanol 100 %    45 Min.

An diesem Punkt sollte fast das gesamte Wasser aus der Probe entfernt sein. Was bleibt, ist ein kleiner Rest molekular gebundenes Wasser.

4. Klärung

Obwohl das Gewebe jetzt im Wesentlichen wasserfrei ist, kann es leider immer noch nicht mit Paraffin infiltriert werden, weil Wachs und Ethanol nur sehr schlecht mischbar sind. Daher muss ein Zwischenlösungsmittel verwendet werden, das vollständig mit Ethanol und Paraffinwachs mischbar ist. Nach einem ähnlichen Prinzip, wie es für die Entwässerung beschrieben wurde, soll dieses Zwischenlösungsmittel zunächst den Alkohol ersetzen und schließlich selbst von Paraffin verdrängt werden. Dieser Prozess wird Klärung genannt und das verwendete Reagens wird als Klärmittel bezeichnet. Dieser Begriff wurde gewählt, weil viele (aber nicht alle) Klärmittel dem Gewebe aufgrund ihres relativ hohen Brechungsindex eine optische Klarheit oder Transparenz verleihen. Eine weitere wichtige Funktion des Klärmittels besteht darin, einen wesentlichen Teil des Fettes aus dem Gewebe zu entfernen, das seinerseits eine Barriere für die Infiltration mit Wachs darstellt.

Ein beliebtes Klärmittel ist Xylol und es sind mehrere Wechsel der Klärlösung erforderlich, bis aller Alkohol aus der Probe entfernt ist.

Ein typisches Protokoll zur Klärung von Proben, die nicht dicker als 4 mm sind, sieht wie folgt aus:

1. Xylol   20 Min.
2. Xylol   20 Min. 
3. Xylol   45 Min.

5. Wachsinfiltration

Das Gewebe kann nun mit einem geeigneten histologischen Wachs infiltriert werden. Obwohl über die Jahre hinweg viele verschiedene Reagenzien vorgeschlagen und hinsichtlich ihrer Vor- und Nachteile evaluiert wurden, sind die paraffinbasierten Wachse nach wie vor die beliebtesten. Ein typisches histologisches Wachs ist bei 60 °C flüssig und kann bei dieser Temperatur infiltriert werden, um dann auf 20 °C abzukühlen, wobei es aushärtet und eine Konsistenz erreicht, die es ermöglicht, Dünnschnitte anzufertigen. Diese Wachse sind Mischungen aus gereinigtem Paraffinwachs und verschiedenen Zusatzstoffen, darunter Polyethylen, Styrol und andere Harze. Diese Formulierungen verleihen dem Reagens besondere physikalische Eigenschaften, dank derer sich das infiltrierte Gewebe in Schnitte schneiden lässt, die nicht dicker als 2 µm sind – und manchmal gar noch dünner. Auch sorgen sie dafür, dass sich beim Schneiden im Mikrotom Schnittbänder bilden, die ausreichend elastisch bleiben, um sich während des Aufschwimmens im warmen Wasserbad vollständig zu glätten.

Ein typisches Protokoll zur Infiltration von Proben, die nicht mehr als 4 mm dick sind, sieht wie folgt aus:

1. Wachs      30 Min.
2. Wachs      30 Min.
3. Wachs      45 Min.

  6. Einbettung

Nun, da die Probe vollständig mit Wachs infiltriert ist, muss sie zu einem „Block“ geformt werden, der in das Mikrotom eingespannt und geschnitten werden kann. Für diesen Schritt wird eine „Einbettstation“ genutzt, in der die Probe in eine mit geschmolzenem Wachs gefüllte Gussform gelegt wird. Die Orientierung der Probe in der Form darf dabei nicht dem Zufall überlassen werden. Es ist zu bedenken, wie der Block ins Mikrotom gespannt und geschnitten werden soll. Die untersuchungsrelevanten Gewebeabschnitte müssen in der Schnittebene zu liegen kommen und zusammenhängend darstellbar sein. Schließlich wird die Kassette, in der die Probe zuvor fixiert wurde, auf den Block gesetzt und mit etwas zusätzlichem Wachs an diesem befestigt. Auf einer Kühlplatte lässt man das Ganze dann abkühlen und aushärten. Sobald sich das Wachs verfestigt hat, kann der Block mit der anhängenden Kassette aus der Gussform entnommen werden und ist bereit für die Mikrotomie. Wenn das Gewebe bis zu diesem Punkt ordnungsgemäß verarbeitet wurde, ist es stabil und kann im Block über längere Zeit gelagert werden. Auf Teile der Probe, die nicht sofort geschnitten werden, kann man dann zurückgreifen, falls später weitere Untersuchungen erforderlich werden.

Trotz seiner Beliebtheit als Klärmittel muss darauf hingewiesen werden, dass Xylol gesundheitsschädigend ist. In einigen Laboren ist man bereits auf weniger toxische Alternativen umgestiegen und verwendet sogenannte Xylolersatzstoffe wie Isopropanol. Zur erfolgreichen Klärung mit Isopropanol sind höhere Wachstemperaturen erforderlich, da Isopropanol nur so durch das Wachs aus dem Gewebe verdrängt werden kann.

Auswirkungen der Gewebeverarbeitung auf die Proben

Fixierung und Infiltration sollen das Gewebe stützen und es ist unvermeidlich, dass neben der Härtung auch eine Schrumpfung auftritt. Es wurde geschätzt, dass Proben bis zur Infiltration bis zu 20 % ihres Volumens verlieren⁴. Ungeachtet dieser Effekte zeigen Schnitte, die aus optimal verarbeitetem Gewebe erstellt werden, durchgehend präzise morphologische Details, die es ermöglichen, Proben zu vergleichen und histopathologische Diagnosen zu stellen.

Theorie und Praxis bestätigen, dass Paraffinblöcke, die relativ homogenes Gewebe von gleichmäßiger weicher Konsistenz enthalten, am einfachsten zu schneiden sind. Dazu gehören beispielsweise Nierenproben, deren Konsistenz nach der Infiltration der Beschaffenheit von Wachs allein ähnelt. Dichteres oder fibröses Gewebe sowie Proben, die sowohl harte als auch weiche Anteile umfassen, können eine größere Herausforderung darstellen. Hier bietet das Wachs den einzelnen Schichten unterschiedlich starken Halt, was dazu führen kann, dass das Gewebe beim Schneiden bricht. Das Problem verschärft sich noch, wenn die verschiedenen Gewebeanteile während der Fixierung und Infiltration unterschiedlich stark schrumpfen.

Auf ihrem Weg vom Patienten zum Pathologen erfordert die Vorbereitung einer Gewebeprobe für die histologische Untersuchung Sorgfalt, Geschick und verlässliche Verfahren. Dieser Leitfaden gibt praktische Ratschläge zu bewährten Methoden und erklärt, wie häufige Fehler vermieden werden können.

Tipps für eine bessere Gewebeinfiltration und Einbettung sind in diesem Handbuch hervorgehoben. Wir hoffen, dass die einzelnen Schritte helfen, die gute histologische Praxis in Erinnerung zu rufen, und dass sie die Fehlersuche vereinfachen, wenn die Ergebnisse mal nicht zufriedenstellend sein sollten.

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Das Protokoll wird in Abhängigkeit von Gewebetyp und Probengröße gewählt.

Das Protokoll passt nicht zur Probe. Unter Umständen wird ein zu langes Protokoll für eine kleine endoskopische Biopsie gewählt oder ein sehr kurzes für eine große Brustprobe mit hohem Fettanteil.

Um eine optimale Infiltration und gute Morphologie zu erreichen, wird das Gewebe stets ausreichend fixiert. Für unvollständig fixierte Proben ist eine zusätzliche Formalinfixierung vorgesehen.

Unvollständig fixierte Proben werden direkt in Alkohol gelegt, was zu einer zonalen Fixierung führt: einer Formalinfixierung im Außenbereich der Probe, einer Fixierung durch Alkohol in der Tiefe.

Die Reagenzien werden streng nach Protokoll ausgetauscht, idealerweise unter Anwendung eines Reagenzien-Management-Systems in einem modernen Gewebeinfiltrationsautomaten wie dem PELORIS von Leica Biosystems.

Die Richtlinien für die Erneuerung von Reagenzien werden ignoriert oder gestreckt, d. h. es kommen verunreinigte, verdünnte oder gar unwirksame Reagenzien zum Einsatz. Warnungen zur Grenzwertüberschreitung, wie sie vom Reagenzien-Management-System PELORIS ausgegeben werden, werden ignoriert. Dies kann zu einer schlechten Infiltrationsqualität führen.

Für die Infiltration und vor allem für das Einbetten wird hochwertiges Wachs verwendet, um qualitativ hochwertige Blöcke zu erhalten, die sich leicht schneiden lassen.

Zur Infiltration und Einbettung wird billiges, minderwertiges Wachs zweifelhafter Herkunft genutzt. Wachs von schlechter Qualität erzeugt Blöcke, die beim Schneiden Probleme machen.

Wenn möglich, werden xylolfreie Formulierungen verwendet, so etwa bei Einsatz des PELORIS von Leica Biosystems. So wird für mehr Sicherheit im Labor gesorgt, ohne die Infiltrationsqualität zu beeinträchtigen.

Das gesundheitsschädigende Potenzial von Xylol findet keine Berücksichtigung. Alternativen werden nicht in Betracht gezogen.

Die Proben werden sorgfältig ausgerichtet. Der fachgerechte Zuschnitt sorgt bei den meisten Proben für eine flache Oberfläche. Das Personal, das die Einbettung vornimmt, hat jederzeit Zugang zur Probenbeschreibung und ist entsprechend geschult.

Die Ausrichtung ist falsch. Unter Umständen wird eine neuerliche Einbettung erforderlich, was zum Verlust von Gewebe führt. Weiterhin machen schlecht ausgerichtete Proben ein umfangreiches Trimmen notwendig, bevor ein vollflächiger Schnitt erstellt werden kann.

Für jede Probe wird eine Gussform in geeigneter Größe gewählt.

Alle Proben werden in gleich großen Formen eingebettet. Dabei berührt das Gewebe möglicherweise den Rand der Form.

Die Einbettung erfolgt vorsichtig, bei schonender Behandlung der Proben.

Die Proben werden während des Einbettens grob behandelt und möglicherweise in die Gussform gedrückt, damit sie flach zu liegen kommen. Dabei werden unter Umständen Gewebebrüche provoziert.

Vor der Handhabung von Gewebe werden die Pinzetten bis nahe an den Schmelzpunkt des Wachses erhitzt.

Die Pinzetten werden weit über den Schmelzpunkt des Wachses erhitzt. Dies kann zu lokalen Hitzeschäden und einer Veränderung der Morphologie in anliegenden Bereichen führen.

Die Temperatur der Heizplatte der Einbettstation und des Wachsreservoirs wird regelmäßig überprüft.

Die Temperatur der Heizplatte der Einbettstation findet keine Beachtung. Dabei wird übersehen, dass auch in diesem Stadium der Probenbearbeitung Hitzeschäden gesetzt werden können.

Die Gussformen sind optimal gefüllt und laufen nicht über.

Die Gussformen sind überfüllt, sodass die Rückseite und die Kanten der Kassetten vor der Mikrotomie abgeschabt werden müssen. Wird auch davon abgesehen und werden Kassetten aus überfüllten Formen ins Mikrotom eingesetzt, so geht dies häufig mit Instabilität einher. Das macht die entsprechenden Proben anfällig für eine Beschädigung während der Mikrotomie.

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